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細(xì)菌內(nèi)毒素檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-13 11:03:28 更新時(shí)間：2025-03-12 11:04:30

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（Bacterial Endotoxin Test, BET）用于檢測藥品、醫(yī)療器械、生物制品等樣品中革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素（脂多糖，LPS）的污染水平，確保產(chǎn)品符合藥典安全要求。以下是基于 《中國藥典》2020年版四部通則1143、USP <85> 及 ISO 11737-2:2019 的系統(tǒng)化檢測方案：

一、檢測方法與原理

方法	原理	適用場景
凝膠法（Gel-Clot）	鱟試劑（LAL）與內(nèi)毒素反應(yīng)形成凝膠，通過目視判斷終點(diǎn)（陽性/陰性）	定性或半定量（干擾較少樣品）
動(dòng)態(tài)濁度法（Kinetic Turbidimetric）	實(shí)時(shí)監(jiān)測濁度變化速率，計(jì)算內(nèi)毒素濃度（EU/mL）	高靈敏度、定量分析（復(fù)雜基質(zhì)樣品）
終點(diǎn)顯色法（Chromogenic）	內(nèi)毒素激活鱟試劑中的酶，水解顯色底物，測定吸光度（405nm）定量	高精度定量（需分光光度計(jì)）

二、核心檢測步驟

1. 樣品預(yù)處理

溶解/稀釋：根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適溶劑（如水、BET水），按最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）稀釋至無干擾濃度。
干擾驗(yàn)證：確認(rèn)樣品稀釋液對(duì)鱟試劑無抑制/增強(qiáng)作用（回收率50%~200%）。

2. 鱟試劑反應(yīng)

凝膠法：
- 樣品與鱟試劑（靈敏度λ，如0.25 EU/mL）等體積混合，37℃±1℃孵育60±2分鐘；
- 倒轉(zhuǎn)試管觀察凝膠形成（陽性：凝膠不流動(dòng)；陰性：液體流動(dòng)）。
動(dòng)態(tài)濁度法：
- 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.03~5.0 EU/mL），樣品與鱟試劑混合后實(shí)時(shí)監(jiān)測吸光度變化（340nm）；
- 計(jì)算反應(yīng)時(shí)間（T）對(duì)數(shù)與內(nèi)毒素濃度（C）的線性關(guān)系：log C = a + b·log T。

3. 結(jié)果計(jì)算與判定

內(nèi)毒素限值（L）：根據(jù)產(chǎn)品給藥途徑設(shè)定（如注射劑：L=K/M，K=5 EU/kg/h，M為最大劑量/kg/h）；
合格標(biāo)準(zhǔn)：樣品內(nèi)毒素濃度（C）≤L（若C>L需復(fù)測或調(diào)查污染源）。

三、關(guān)鍵設(shè)備與試劑

設(shè)備/試劑	用途	推薦型號(hào)/品牌
鱟試劑（LAL）	內(nèi)毒素特異性反應(yīng)試劑	Lonza PyroGene™（靈敏度0.03~5.0 EU/mL）
內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）	校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線（USP標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC6）	USP Endotoxin Reference Standard（EC6）
動(dòng)態(tài)濁度儀	實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)濁度變化	Charles River Endosafe® Nexgen™
恒溫水浴箱	精確控溫（37℃±0.5℃）	Thermo Scientific Precision™
無熱原耗材	避免外源性內(nèi)毒素污染	無熱原槍頭、離心管（DEPC處理）

四、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	處理措施
假陽性/假陰性	樣品干擾（如β-葡聚糖、高鹽）	稀釋樣品至無干擾濃度，或改用特異性鱟試劑（如重組C因子法）
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差	內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品降解或儀器校準(zhǔn)偏差	更換新鮮標(biāo)準(zhǔn)品，重新校準(zhǔn)儀器（R²≥0.980）
凝膠法終點(diǎn)模糊	孵育時(shí)間/溫度波動(dòng)或鱟試劑靈敏度低	嚴(yán)格控溫（±0.5℃），選擇高靈敏度鱟試劑（如λ=0.03 EU/mL）
背景濁度高	樣品顆粒物或蛋白質(zhì)沉淀	離心（10,000×g×10min）或過濾（0.22μm濾膜）

五、法規(guī)符合性要求

法規(guī)/標(biāo)準(zhǔn)	核心要求	適用地區(qū)
《中國藥典》2020	凝膠法、動(dòng)態(tài)濁度法、顯色法均適用，樣品需通過干擾驗(yàn)證	中國境內(nèi)藥品/醫(yī)療器械上市
USP <85>	動(dòng)態(tài)濁度法需驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍（0.03~5.0 EU/mL），回收率50%~200%	美國市場準(zhǔn)入
ISO 11737-2:2019	醫(yī)療器械滅菌驗(yàn)證中內(nèi)毒素檢測，需結(jié)合生物負(fù)載檢測（總污染≤0.5 EU/器械）	全球醫(yī)療器械注冊(cè)
EP 2.6.14	顯色法需驗(yàn)證顯色底物穩(wěn)定性，檢測限（LOD）≤0.005 EU/mL	歐洲藥品市場

六、檢測報(bào)告與記錄

報(bào)告內(nèi)容：
- 樣品信息（批號(hào)、稀釋倍數(shù)、MVD計(jì)算）；
- 檢測方法（凝膠法/動(dòng)態(tài)濁度法）、標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)（R²值、斜率）；
- 結(jié)果判定（內(nèi)毒素濃度 vs. 限值）、干擾驗(yàn)證結(jié)論。
記錄保存：
- 原始數(shù)據(jù)（吸光度曲線、凝膠照片）保存≥產(chǎn)品有效期+1年；
- 鱟試劑批號(hào)、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溯源信息需完整記錄。

通過系統(tǒng)化檢測，可確保樣品中內(nèi)毒素污染水平符合藥典要求。建議企業(yè)建立 內(nèi)毒素?cái)?shù)據(jù)庫 跟蹤原料與成品的污染趨勢(shì)，并針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品（如注射劑、植入器械）實(shí)施 過程控制（如內(nèi)毒素清除工藝驗(yàn)證）。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品（如血液制品），推薦使用 重組C因子法（特異性高，抗干擾性強(qiáng)）替代傳統(tǒng)鱟試劑。