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HPLC（高效液相色譜）分析

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-13 10:46:27 更新時(shí)間：2025-03-12 10:46:37

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

HPLC（高效液相色譜）分析需圍繞 方法開發(fā)、儀器校準(zhǔn)、樣品處理、分離優(yōu)化及數(shù)據(jù)解析 等核心步驟展開，適用于藥物、食品、環(huán)境及化工產(chǎn)品的定性與定量分析。以下是基于 USP <621>（色譜法通則）、ICH Q2(R1)（分析方法驗(yàn)證） 及 GB/T 16631-2019（液相色譜分析方法通則） 的系統(tǒng)化操作指南：

一、HPLC核心組件與參數(shù)優(yōu)化

組件/參數(shù)	功能與優(yōu)化要點(diǎn)	推薦配置/標(biāo)準(zhǔn)
色譜柱	C18反相柱（5μm, 4.6×250mm）、HILIC親水柱	根據(jù)極性選擇（如Waters XBridge® C18）
流動相	乙腈-水/緩沖鹽（pH 2~8）、梯度洗脫程序	避免使用磷酸鹽（易結(jié)晶堵塞）
流速	1.0 mL/min（常規(guī)分析）、0.2 mL/min（微徑柱）	柱壓≤4000 psi（避免超壓）
檢測器	UV-Vis（190~400nm）、DAD（多波長）、ELSD（蒸發(fā)光散射）	Agilent 1260 DAD（波長精度±1nm）
柱溫箱	25~40℃（溫度穩(wěn)定性±0.5℃）	高溫分析需選耐高溫柱（如ZORBAX SB-C18）

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

1. 方法開發(fā)與驗(yàn)證

目標(biāo)物特性分析：
- 溶解性（logP）、pKa值（影響離子化）、紫外吸收波長（λmax）。
色譜條件初篩：
- 流動相比例（如乙腈:水=50:50），梯度優(yōu)化（0~100%乙腈/20min）。
系統(tǒng)適用性測試：
- 理論塔板數(shù)（N≥2000）、分離度（Rs≥1.5）、拖尾因子（0.9~1.2）。

2. 樣品前處理

固體樣品：
1. 粉碎后超聲提?。状?乙腈溶劑），0.22μm濾膜過濾。
液體樣品：
1. 稀釋/濃縮至線性范圍，SPE（固相萃取）凈化（如C18柱去基質(zhì)干擾）。

3. 儀器操作步驟

啟動與平衡：
- 流動相脫氣（超聲或在線脫氣機(jī)），以初始比例平衡色譜柱至基線穩(wěn)定（約10倍柱體積）。
進(jìn)樣與分析：
- 進(jìn)樣量10~20μL（避免超載），記錄保留時(shí)間與峰面積。
數(shù)據(jù)采集與處理：
- 積分參數(shù)設(shè)置（斜率靈敏度、峰寬閾值），外標(biāo)法/內(nèi)標(biāo)法定量。

三、關(guān)鍵性能驗(yàn)證指標(biāo)

參數(shù)	定義與要求	計(jì)算公式/判定標(biāo)準(zhǔn)
保留時(shí)間重復(fù)性	連續(xù)進(jìn)樣RSD≤1%	RSD = (SD/Mean) × 100%
線性范圍	R²≥0.999（至少5個(gè)濃度點(diǎn)）	最小二乘法擬合，殘差分析
檢出限（LOD）	S/N≥3	LOD = 3.3 × SD/slope
定量限（LOQ）	S/N≥10	LOQ = 10 × SD/slope
回收率	加標(biāo)回收率80%~120%	回收率 = (測定值/加標(biāo)量) × 100%

四、常見問題與解決方案

現(xiàn)象	可能原因	解決措施
峰拖尾	柱效下降或流動相pH不匹配	更換色譜柱，調(diào)節(jié)流動相pH（±0.5）
基線漂移	流動相比例波動或溫度不穩(wěn)定	使用梯度延遲體積小的混合器，穩(wěn)定柱溫箱
保留時(shí)間漂移	柱溫波動或流速不穩(wěn)定	檢查泵密封圈，確保柱溫箱設(shè)定準(zhǔn)確
鬼峰（Ghost Peaks）	進(jìn)樣污染或流動相雜質(zhì)	超純水沖洗系統(tǒng)，使用HPLC級溶劑

五、典型應(yīng)用案例

應(yīng)用領(lǐng)域	分析目標(biāo)	色譜條件
藥物分析	阿司匹林含量測定（USP 40）	C18柱，乙腈-0.1%磷酸（40:60），流速1mL/min，λ=276nm
食品安全	防腐劑（苯甲酸、山梨酸）檢測	HILIC柱，乙腈-20mM乙酸銨（85:15），DAD多波長檢測
環(huán)境監(jiān)測	多環(huán)芳烴（PAHs）定量	C18柱，乙腈-水梯度洗脫，熒光檢測器（Ex 260nm/Em 420nm）
代謝組學(xué)	氨基酸/有機(jī)酸譜分析	親水相互作用色譜（HILIC），Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)用

六、維護(hù)與故障排除

日常維護(hù)：
- 每次使用后以高純度溶劑沖洗色譜柱（如乙腈:水=80:20）；
- 定期更換泵密封圈（每6個(gè)月或壓力波動時(shí)）。
故障排查工具：
- 壓力異常：檢查過濾器堵塞、管路氣泡或柱頭篩板污染；
- 峰形異常：驗(yàn)證樣品溶劑與流動相兼容性，避免強(qiáng)溶劑效應(yīng)。

通過系統(tǒng)化HPLC分析，可精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的分離與定量。建議結(jié)合 QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)） 理念優(yōu)化方法開發(fā)流程，并針對痕量分析（如農(nóng)殘、激素）采用 SPE或LLE（液液萃取） 富集技術(shù)。對于極性差異大的組分，可探索 UHPLC（超高效液相色譜） 提升分離效率（柱長50~~100mm，粒徑1.7~~2μm）。