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氨基酸分析

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-13 13:22:00 更新時(shí)間：2025-03-12 13:23:01

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

氨基酸分析需圍繞 結(jié)構(gòu)鑒定、純度評(píng)估、含量測(cè)定及手性分析 展開，適用于蛋白質(zhì)組學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)、藥物質(zhì)量控制等領(lǐng)域。以下是基于 《中國(guó)藥典》2020年版四部通則、USP <1052>（氨基酸分析） 及 ISO 13903:2005（動(dòng)物飼料氨基酸測(cè)定） 的系統(tǒng)化檢測(cè)方案：

一、核心檢測(cè)項(xiàng)目與技術(shù)

檢測(cè)類別	關(guān)鍵參數(shù)	檢測(cè)方法	適用場(chǎng)景
定性鑒定	氨基酸種類（20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸）	離子交換色譜（IEC）+ 茚三酮衍生法	蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物鑒定
定量分析	各氨基酸含量（μg/mg或μmol/g）	HPLC-熒光檢測(cè)（OPA/FMOC柱前衍生）	食品/飼料營(yíng)養(yǎng)分析
手性拆分	D/L-氨基酸比例	手性柱（Chiralpak®）分離 + 質(zhì)譜鑒定	藥物雜質(zhì)控制（如左旋多巴）
游離氨基酸	血清/組織中游離氨基酸譜	LC-MS/MS（同位素內(nèi)標(biāo)法）	代謝疾病診斷（如苯丙酮尿癥）
氨基酸序列	多肽/蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)解析	Edman降解 + 質(zhì)譜測(cè)序	生物制藥質(zhì)量控制

二、檢測(cè)設(shè)備與試劑

設(shè)備/試劑	用途	推薦型號(hào)/品牌
氨基酸分析儀	離子交換色譜（IEC）分離 + 茚三酮衍生	Hitachi L-8900（標(biāo)配20種氨基酸分析）
HPLC-熒光檢測(cè)系統(tǒng)	高靈敏度定量（OPA/FMOC衍生法）	Agilent 1260 Infinity II（ZORBAX Eclipse AAA色譜柱）
手性色譜柱	D/L-氨基酸對(duì)映體拆分	Daicel Chiralpak® ZWIX(+)（3μm, 150×2.1mm）
同位素內(nèi)標(biāo)	校正基質(zhì)效應(yīng)與回收率偏差	Cambridge Isotope Laboratories（¹³C/¹?N標(biāo)記氨基酸）
水解試劑	蛋白質(zhì)酸水解（6M HCl, 110℃×24h）	Thermo Scientific Pierce™ 水解管套裝

三、標(biāo)準(zhǔn)化分析流程

1. 樣品前處理

蛋白質(zhì)水解：
1. 樣品（1~5mg）加入6M HCl（含0.1%苯酚），真空封管；
2. 110℃水解24小時(shí)，冷卻后氮吹干燥，復(fù)溶于稀釋液（pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液）。
游離氨基酸提取：
1. 生物樣本（血清/組織）用磺基水楊酸沉淀蛋白（4% w/v），離心取上清；
2. 超濾（10kDa）去除大分子干擾物。

2. 衍生化方法選擇

衍生試劑	反應(yīng)條件	檢測(cè)方式	優(yōu)勢(shì)
鄰苯二甲醛（OPA）	堿性條件（pH 9.5）下與伯胺反應(yīng)，室溫1min	熒光檢測(cè)（Ex 340nm/Em 450nm）	快速衍生（僅伯氨基酸響應(yīng)）
FMOC-Cl	堿性條件（pH 8.0）下與伯/仲胺反應(yīng)，室溫5min	熒光檢測(cè)（Ex 266nm/Em 305nm）	檢測(cè)所有氨基酸（含脯氨酸）
丹磺酰氯	堿性條件（pH 9.0）下反應(yīng)，60℃×1h	紫外檢測(cè)（254nm）或熒光檢測(cè)	穩(wěn)定性高，適合復(fù)雜基質(zhì)

3. 色譜條件優(yōu)化（以HPLC-OPA法為例）

色譜柱：ZORBAX Eclipse AAA（4.6×150mm, 3.5μm）；
流動(dòng)相：
- A相：40mM Na?HPO?（pH 7.8）；
- B相：乙腈:甲醇:水=45:45:10（v/v/v）；
梯度程序：0min 2% B → 15min 57% B → 18min 100% B（流速1.5mL/min）；
檢測(cè)器：熒光檢測(cè)（Ex 340nm, Em 450nm）。

4. 定量分析（內(nèi)標(biāo)法）

內(nèi)標(biāo)選擇：添加非天然氨基酸（如正亮氨酸）或同位素內(nèi)標(biāo)（如¹³C-丙氨酸）；
標(biāo)準(zhǔn)曲線：覆蓋待測(cè)氨基酸線性范圍（0.1~100μg/mL），R²≥0.995；
含量計(jì)算：氨基酸含量(μg/g)=C樣品×V定容m樣品氨基酸含量(μg/g)=m樣品?C樣品?×V定容?? （C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的濃度，V：定容體積，m：樣品質(zhì)量）

四、方法驗(yàn)證與數(shù)據(jù)質(zhì)量

驗(yàn)證參數(shù)	要求	參考標(biāo)準(zhǔn)
精密度	重復(fù)性RSD≤5%，中間精密度RSD≤10%	ICH Q2(R1)
準(zhǔn)確度	加標(biāo)回收率85%~115%（不同濃度水平）	AOAC 994.12
線性范圍	覆蓋樣品濃度范圍，R²≥0.99	USP <1052>
檢測(cè)限（LOD）	S/N≥3對(duì)應(yīng)濃度（如0.05μg/mL）	ISO 11843-1
定量限（LOQ）	S/N≥10對(duì)應(yīng)濃度（如0.1μg/mL）	ISO 11843-1

五、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	優(yōu)化策略
色譜峰分叉/拖尾	色譜柱污染或柱效下降	再生色譜柱（0.1M NaOH沖洗），更換保護(hù)柱
衍生效率低	反應(yīng)pH或時(shí)間不適宜	優(yōu)化衍生試劑pH（如OPA法pH調(diào)至9.5±0.2）
內(nèi)標(biāo)回收率偏差	基質(zhì)效應(yīng)或內(nèi)標(biāo)選擇不當(dāng)	改用同位素內(nèi)標(biāo)（如¹³C-谷氨酸），SPE凈化基質(zhì)
脯氨酸未檢出	OPA僅衍生伯胺（脯氨酸為仲胺）	聯(lián)用FMOC-Cl衍生仲胺基團(tuán)

六、應(yīng)用場(chǎng)景與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

領(lǐng)域	檢測(cè)重點(diǎn)	參考標(biāo)準(zhǔn)
食品營(yíng)養(yǎng)	必需氨基酸含量（如賴氨酸、色氨酸）	GB 5009.124-2016（食品中氨基酸測(cè)定）
生物制藥	重組蛋白氨基酸序列驗(yàn)證	《中國(guó)藥典》2020 通則 3121（肽圖分析）
臨床診斷	血漿游離氨基酸譜（代謝疾病篩查）	CLSI C62-A（臨床質(zhì)譜方法驗(yàn)證）
飼料工業(yè)	總氨基酸與可利用氨基酸評(píng)估	ISO 13903:2005（動(dòng)物飼料氨基酸分析）