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微生物限度檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-13 13:21:46 更新時(shí)間：2025-03-12 13:21:57

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

微生物限度檢測(cè)旨在評(píng)估藥品、醫(yī)療器械、食品及化妝品等產(chǎn)品中微生物污染水平，確保其符合衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)。以下是基于 《中國(guó)藥典》2020版四部通則1105/1106、ISO 11737-1（醫(yī)療器械滅菌微生物方法） 及 GB 4789.2-2022（食品微生物檢驗(yàn)） 的系統(tǒng)化檢測(cè)方案：

一、核心檢測(cè)項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)限值

檢測(cè)類別	關(guān)鍵參數(shù)	檢測(cè)方法	判定標(biāo)準(zhǔn)
需氧菌總數(shù)（TAMC）	需氧菌及兼性厭氧菌菌落計(jì)數(shù)	平皿法（TSA培養(yǎng)基，30~~35℃×3~~5天）	口服制劑≤10³ CFU/g（中國(guó)藥典）
霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）	霉菌與酵母菌菌落計(jì)數(shù)	SDA培養(yǎng)基（20~~25℃×5~~7天）	非無(wú)菌制劑≤10² CFU/g
控制菌檢查	大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等	選擇性培養(yǎng)基+生化鑒定（如麥康凱瓊脂、BP平板）	不得檢出（藥典規(guī)定）
耐膽鹽革蘭陰性菌	特定腸桿菌科細(xì)菌檢測(cè)	腸道菌增菌液（EE肉湯）+VRBG瓊脂	醫(yī)療器械≤10 CFU/件（ISO 11737）

二、標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程

1. 樣品前處理

藥品/化妝品：
1. 液體樣品：直接取樣或稀釋（pH 7.0 PBS）；
2. 固體樣品：均質(zhì)（拍打式均質(zhì)器，200rpm×2min），制成1:10懸液。
醫(yī)療器械：
1. 洗脫法：超聲處理（40kHz×30min）或震蕩洗脫（含中和劑的PBS）；
2. 膜過(guò)濾法：樣品浸提液通過(guò)0.45μm濾膜，濾膜貼于培養(yǎng)基。

2. 微生物計(jì)數(shù)（平皿法）

傾注培養(yǎng)：
- 取1mL樣品液加入無(wú)菌平皿，倒入TSA/SDA培養(yǎng)基（45~50℃），搖勻凝固；
- TSA（需氧菌）：30~~35℃培養(yǎng)3~~5天；SDA（霉菌/酵母菌）：20~~25℃培養(yǎng)5~~7天。
菌落計(jì)數(shù)：
- 選擇菌落數(shù)30~300 CFU的平皿，計(jì)算平均值；
- 計(jì)算公式：菌落數(shù) (CFU/g或mL)=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)樣品量菌落數(shù)(CFU/g或mL)=樣品量平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)?

3. 控制菌檢查（以大腸埃希菌為例）

增菌培養(yǎng)：樣品液接種于麥康凱肉湯（37℃×24h）；
分離培養(yǎng)：劃線接種麥康凱瓊脂（37℃×24h），觀察粉紅色菌落；
生化確認(rèn)：IMViC試驗(yàn)（吲哚+/甲基紅+/VP-/枸櫞酸鹽-）。

三、關(guān)鍵設(shè)備與耗材

設(shè)備/耗材	用途	推薦型號(hào)/品牌
拍打式均質(zhì)器	固體樣品均質(zhì)化	Seward Stomacher® 400 Circulator
微生物培養(yǎng)箱	需氧/厭氧環(huán)境培養(yǎng)	Memmert INCOmed（溫控精度±0.5℃）
膜過(guò)濾系統(tǒng)	低微生物負(fù)荷樣品濃縮檢測(cè)	Milliflex® Quantum（默克）
菌落計(jì)數(shù)器	自動(dòng)菌落識(shí)別與統(tǒng)計(jì)	Synbiosis ProtoCOL 3
選擇性培養(yǎng)基	控制菌分離（如BP瓊脂、XLD瓊脂）	海博生物（HB0388/XLD培養(yǎng)基）

四、方法適用性驗(yàn)證

回收率測(cè)試：
- 接種已知濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株（如金黃色葡萄球菌ATCC 6538）至樣品中，計(jì)算回收率；
- 要求：需氧菌回收率≥70%，控制菌應(yīng)100%檢出。
干擾物質(zhì)中和：
- 含抑菌性樣品需添加中和劑（如聚山梨酯80、卵磷脂）；
- 驗(yàn)證方法：比較添加中和劑前后的微生物回收率差異（應(yīng)無(wú)顯著抑制）。

五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

問(wèn)題現(xiàn)象	可能原因	改進(jìn)措施
平皿菌落過(guò)度生長(zhǎng)	樣品微生物負(fù)荷過(guò)高	增加稀釋梯度（如10?³→10??），優(yōu)化取樣量
回收率低	樣品殘留抑菌成分未被中和	調(diào)整中和劑類型（如吐溫80+組氨酸），延長(zhǎng)中和時(shí)間
控制菌假陰性	選擇性培養(yǎng)基靈敏度不足	更換高選擇性培養(yǎng)基（如ChromID™沙門菌顯色培養(yǎng)基）
霉菌污染擴(kuò)散	培養(yǎng)環(huán)境濕度過(guò)高或交叉污染	使用獨(dú)立培養(yǎng)箱分隔霉菌樣品，控制濕度≤60% RH

六、合規(guī)性報(bào)告與認(rèn)證

報(bào)告內(nèi)容：
- 樣品信息（批號(hào)、規(guī)格）、檢測(cè)方法（藥典條款）、菌落計(jì)數(shù)結(jié)果；
- 方法適用性數(shù)據(jù)（回收率、中和劑驗(yàn)證）、結(jié)論（是否符合限值）。
認(rèn)證要求：
- 藥品/醫(yī)療器械：中國(guó)藥典/ USP <61>/ ISO 11737 + GMP實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證；
- 食品：GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn) + CNAS/CMA資質(zhì)；
- 化妝品：化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2023版） + ISO 22716（生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范）。

通過(guò)系統(tǒng)化微生物限度檢測(cè)，可有效評(píng)估產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量，預(yù)防微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。建議結(jié)合 快速微生物檢測(cè)技術(shù)（如ATP生物熒光法）縮短檢測(cè)周期，并對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)樣品（如無(wú)菌制劑）實(shí)施 環(huán)境監(jiān)測(cè)（沉降菌/浮游菌采樣）。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的樣品，推薦使用 薄膜過(guò)濾法 結(jié)合中和劑處理，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。