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微核試驗

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發(fā)布時間：2025-03-13 11:17:59 更新時間：2025-03-12 11:19:07

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

微核試驗是一種用于評估化學(xué)物質(zhì)、藥物或輻射等外源因素對遺傳物質(zhì)損傷的經(jīng)典方法，通過檢測細(xì)胞分裂后殘留的微核（染色體斷片或整條染色體未進(jìn)入主核）數(shù)量，判斷其致突變性與遺傳毒性。以下是基于 OECD 487（體外微核試驗）、OECD 474（體內(nèi)微核試驗） 及 ICH S2(R1)（藥物遺傳毒性研究） 的系統(tǒng)化檢測指南：

一、試驗類型與適用場景

試驗類型	檢測系統(tǒng)	應(yīng)用場景
體外微核試驗	哺乳動物細(xì)胞（CHO、TK6、人淋巴細(xì)胞）	藥物候選物初篩、化學(xué)品遺傳毒性評估
體內(nèi)微核試驗	小鼠骨髓/外周血紅細(xì)胞、大鼠肝細(xì)胞	藥物臨床前安全性評價、環(huán)境污染物風(fēng)險評估
流式細(xì)胞術(shù)微核檢測	全自動高通量分析（微核率與細(xì)胞周期同步）	大規(guī)?；衔锖Y選與機(jī)制研究

二、核心檢測指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)

檢測指標(biāo)	定義與計算方法	判定標(biāo)準(zhǔn)
微核率（‰）	微核細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1000	體外：陰性對照的2倍或統(tǒng)計學(xué)顯著增加（p<0.05）；體內(nèi)：劑量依賴性顯著升高（背景值：小鼠骨髓約1~3‰）
細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）	PI = (M1 + 2M2 + 3M3)/(M0 + M1 + M2 + M3)（M0~M3：不同分裂期細(xì)胞數(shù)）	PI≥1.5（體外試驗有效性驗證）
核分裂指數(shù)（NDI）	NDI = (M1 + 2M2 + 3M3)/總細(xì)胞數(shù)	體內(nèi)試驗中NDI下降≤50%（避免細(xì)胞毒性干擾）

三、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（以體外哺乳動物細(xì)胞微核試驗為例）

1. 試驗設(shè)計

細(xì)胞選擇：推薦人淋巴細(xì)胞（全血培養(yǎng)法）或CHO細(xì)胞（細(xì)胞株）；
劑量設(shè)置：至少3個濃度（覆蓋IC50的20%~80%），最高濃度不超過10mM或1mg/mL；
對照設(shè)置：
- 陰性對照：溶劑（如DMSO≤1%）；
- 陽性對照：絲裂霉素C（0.1μg/mL）或環(huán)磷酰胺（5μg/mL）。

2. 細(xì)胞處理與采樣

細(xì)胞暴露：
- 加入受試物，37℃/5% CO?培養(yǎng)24~48小時（含細(xì)胞松弛素B阻斷胞質(zhì)分裂）；
細(xì)胞收獲：
- 低滲處理（0.075M KCl，37℃×5min），固定（甲醇:冰醋酸=3:1），滴片干燥；
染色與觀察：
- Giemsa染色（10%，pH 6.8，15min）或熒光染色（DAPI/AO），顯微鏡計數(shù)至少2000個雙核細(xì)胞。

3. 數(shù)據(jù)分析

微核率計算：僅計數(shù)雙核細(xì)胞中的微核（直徑≤1/3主核）；
統(tǒng)計方法：卡方檢驗或Fisher精確檢驗（與陰性對照組對比）。

四、體內(nèi)微核試驗（小鼠骨髓法）

動物處理：
- 雄性小鼠（6~8周），3個劑量組（MTD的25%、50%、75%），連續(xù)給藥2天；
骨髓采樣：
- 末次給藥后24小時，取股骨骨髓細(xì)胞，制片固定；
染色與計數(shù)：
- May-Grünwald/Giemsa染色，計數(shù)2000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE）中的微核。

五、關(guān)鍵注意事項與驗證要求

驗證項目	要求與標(biāo)準(zhǔn)	問題排查
細(xì)胞活力驗證	臺盼藍(lán)拒染率≥70%（體外）	降低受試物濃度或縮短暴露時間
陽性對照有效性	微核率顯著高于陰性對照（p<0.01）	檢查試劑活性或更換陽性物（如秋水仙素）
劑量范圍驗證	最高劑量組細(xì)胞存活率≥50%（體外）	調(diào)整劑量梯度或更換細(xì)胞系
背景微核率控制	陰性對照組微核率符合歷史數(shù)據(jù)（如CHO細(xì)胞≤3‰）	避免實驗環(huán)境誘變劑污染（紫外線/化學(xué)試劑）

六、數(shù)據(jù)解讀與報告

陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：
- 體外：微核率≥2倍陰性對照，且呈劑量依賴性（p<0.05）；
- 體內(nèi)：微核率顯著高于對照組（p<0.01），且PCE/NCE（正常紅細(xì)胞）比值≥0.1（無骨髓抑制）。
報告內(nèi)容：
- 受試物信息（濃度、溶劑）、試驗條件（細(xì)胞類型、暴露時間）、微核率數(shù)據(jù)與統(tǒng)計結(jié)果；
- 結(jié)論（陽性/陰性/不確定）及生物學(xué)意義分析。

七、應(yīng)用場景與法規(guī)依據(jù)

應(yīng)用領(lǐng)域	檢測目的	參考法規(guī)
藥物開發(fā)	遺傳毒性篩選（ICH S2(R1)）	FDA Guidance on Genotoxicity Testing
化學(xué)品注冊	REACH法規(guī)（EC 1907/2006）要求	OECD 487 & 474
環(huán)境監(jiān)測	水體/土壤污染物遺傳毒性評估	ISO 21427-1（水質(zhì)微核試驗）
輻射安全	電離/非電離輻射暴露風(fēng)險評估	IAEA Technical Report Series No. 405

通過系統(tǒng)化微核試驗，可有效評估受試物的遺傳毒性風(fēng)險。建議結(jié)合 彗星試驗（DNA斷裂） 與 染色體畸變分析 進(jìn)行綜合判斷，并利用 自動化圖像分析系統(tǒng)（如MetaSystems Metafer） 提升檢測效率。對于陽性結(jié)果，需進(jìn)一步開展 機(jī)制研究（如微核來源的FISH探針鑒定） ，明確是否為染色體斷裂或非整倍體效應(yīng)。