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脫落酸檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-22 11:06:50 更新時(shí)間：2025-03-21 11:06:58

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

脫落酸（Abscisic Acid, ABA）是植物響應(yīng)逆境（干旱、鹽脅迫等）和調(diào)控生長發(fā)育的關(guān)鍵激素。其檢測(cè)需圍繞 樣本前處理、提取純化、儀器分析、數(shù)據(jù)驗(yàn)證 等核心環(huán)節(jié)展開。以下是脫落酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化流程與技術(shù)要點(diǎn)：

一、樣本采集與預(yù)處理

樣本類型：
- 植物組織：葉片、根尖、種子（快速冷凍避免ABA降解）；
- 細(xì)胞培養(yǎng)液：離心后取上清液（-80℃保存）。
預(yù)處理步驟：
- 速凍研磨：液氮研磨至粉末狀，均勻取樣；
- 滅活酶：加入液氮或沸甲醇終止內(nèi)源酶活性。

二、ABA提取與純化

提取溶劑：
- 甲醇/水混合液（80%甲醇，含1%乙酸），4℃震蕩提取2h（GB/T 35874-2018）；
- 丙酮/水混合液（70%丙酮，pH 2.5）用于脂溶性干擾較多的樣本。
純化方法：
- 固相萃?。⊿PE）：C18柱活化→上樣→洗脫（甲醇:乙酸=9:1）；
- 液液萃取：正己烷去脂，乙酸乙酯萃取ABA。

三、檢測(cè)方法選擇與操作

方法	原理	靈敏度	適用場景
酶聯(lián)免疫法（ELISA）	抗原-抗體特異性結(jié)合，比色法定量	0.1-10 ng/g FW	大批量樣本快速篩查（植物組織）
高效液相色譜（HPLC）	反相C18柱分離，紫外檢測(cè)（λ=254nm）	0.5-50 ng/g FW	實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)，中等通量
LC-MS/MS	同位素內(nèi)標(biāo)（如d6-ABA）定量，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）提高特異性	0.01-5 ng/g FW	高精度科研、復(fù)雜基質(zhì)（土壤/細(xì)胞液）
氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）	衍生化（如甲基化）后檢測(cè)，需復(fù)雜前處理	0.1-10 ng/g FW	早期研究，現(xiàn)較少使用

四、LC-MS/MS檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化流程（以Agilent 6470為例）

色譜條件：
- 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1×100mm, 1.8μm）；
- 流動(dòng)相：A相（0.1%甲酸水），B相（乙腈），梯度洗脫（5%→95% B，10min）；
- 流速：0.3mL/min，柱溫40℃。
質(zhì)譜參數(shù)：
- 離子源：電噴霧電離（ESI），負(fù)離子模式；
- MRM通道：ABA m/z 263→153（定量離子），263→204（定性離子）；
- 內(nèi)標(biāo)：d6-ABA m/z 269→159。
定量計(jì)算：
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線：0.1-100ng/mL，R²≥0.99；
- 回收率：加標(biāo)回收率80%-120%（樣本基質(zhì)校正）。

五、數(shù)據(jù)驗(yàn)證與質(zhì)控

方法驗(yàn)證：
- 檢出限（LOD）：信噪比（S/N）≥3對(duì)應(yīng)的濃度；
- 定量限（LOQ）：S/N≥10，且精密度RSD≤15%；
- 特異性：空白樣本中無ABA峰干擾。
穩(wěn)定性測(cè)試：
- 短期：4℃保存24h，ABA降解≤5%；
- 長期：-80℃保存1個(gè)月，濃度變化≤10%。

六、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	解決方案
回收率偏低	提取效率低或基質(zhì)吸附	優(yōu)化提取溶劑比例（如甲醇:水=8:2），超聲輔助提取
色譜峰拖尾	柱效下降或流動(dòng)相pH不適	更換色譜柱，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至2.5-3.0
質(zhì)譜信號(hào)不穩(wěn)定	離子源污染或電壓波動(dòng)	清洗離子源，校準(zhǔn)質(zhì)量軸，穩(wěn)定電源
ELISA假陽性	交叉反應(yīng)（如類似結(jié)構(gòu)激素）	驗(yàn)證抗體特異性，增加阻斷劑（BSA/脫脂奶粉）

七、應(yīng)用場景與標(biāo)準(zhǔn)參考

植物抗逆研究：
- 干旱脅迫下葉片ABA累積（＞100ng/g FW）；
- 鹽脅迫根系A(chǔ)BA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)（LC-MS/MS時(shí)間序列分析）。
農(nóng)業(yè)育種：
- 篩選高ABA合成基因型（如OsABA2過表達(dá)水稻）；
- 外源ABA處理促進(jìn)種子休眠（濃度50-100μM）。
標(biāo)準(zhǔn)參考：
- 國際：ISO 21479-2019（植物激素檢測(cè)通用方法）；
- 國內(nèi)：GB/T 35874-2018（植物內(nèi)源激素測(cè)定）。