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菌種鑒定

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-13 17:34:02 更新時(shí)間：2025-03-12 17:35:27

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

菌種鑒定需圍繞 形態(tài)學(xué)、生理生化特性、分子生物學(xué)及功能基因分析 等核心維度展開，確保其符合 《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》、CLSI M35-A2（臨床微生物鑒定標(biāo)準(zhǔn)） 及 ISO 16140（分子鑒定驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)） 等規(guī)范。以下是針對(duì) 細(xì)菌、真菌、放線菌 的系統(tǒng)化鑒定方案：

一、核心檢測項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)

鑒定維度	關(guān)鍵方法	檢測技術(shù)/儀器	判定標(biāo)準(zhǔn)
形態(tài)學(xué)鑒定	菌落形態(tài)、革蘭染色、孢子結(jié)構(gòu)	光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡（SEM）	菌落顏色、邊緣、光澤符合標(biāo)準(zhǔn)描述
生理生化試驗(yàn)	糖發(fā)酵、氧化酶、觸酶、API/BIOLOG	API 20E試劑條、VITEK 2 Compact	API代碼與數(shù)據(jù)庫匹配（≥95%置信度）
分子生物學(xué)鑒定	16S rRNA/ITS測序、全基因組測序（WGS）	PCR擴(kuò)增儀、Illumina NovaSeq	16S rRNA相似度≥99%（種水平）
質(zhì)譜鑒定	MALDI-TOF MS蛋白指紋圖譜	Bruker MALDI Biotyper、VITEK MS	Score≥2.0（種級(jí)鑒定可信）
耐藥基因分析	PCR檢測blaNDM-1、mecA等耐藥基因	實(shí)時(shí)熒光PCR（qPCR）、Nanopore測序	耐藥基因與表型一致（CLSI標(biāo)準(zhǔn)）
功能基因分析	次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇（PKS/NRPS）	宏基因組測序、antiSMASH分析	基因簇完整性≥80%

二、標(biāo)準(zhǔn)化鑒定流程

1. 樣本前處理

分離純化：
- 樣本（土壤/臨床標(biāo)本）→梯度稀釋→選擇培養(yǎng)基（如LB/沙氏瓊脂）劃線培養(yǎng)→挑取單菌落；
菌株保存：
- 甘油管（-80℃）或冷凍干燥（Lyophilization）保藏。

2. 形態(tài)學(xué)與生化鑒定

革蘭染色：
- 結(jié)晶紫→碘液→乙醇脫色→番紅復(fù)染→鏡檢（油鏡1000×）；
API 20E測試：
- 接種20項(xiàng)生化反應(yīng)孔→培養(yǎng)24h→比色判讀→輸入APIWEB數(shù)據(jù)庫。

3. 分子生物學(xué)鑒定（以16S rRNA為例）

DNA提取：
- 菌體裂解（溶菌酶+SDS）→酚氯仿抽提→乙醇沉淀；
PCR擴(kuò)增：
- 引物27F/1492R擴(kuò)增16S rRNA基因→瓊脂糖電泳驗(yàn)證；
測序與比對(duì)：
- Sanger測序→BLAST比對(duì)NCBI/EzBioCloud數(shù)據(jù)庫→計(jì)算相似度。

4. MALDI-TOF MS快速鑒定

樣本制備：
- 菌體涂靶板→覆蓋甲酸乙腈提取液→干燥后加基質(zhì)（α-氰基-4-羥基肉桂酸）；
質(zhì)譜檢測：
- 激光激發(fā)→采集蛋白指紋圖譜（m/z 2,000~20,000）；
數(shù)據(jù)庫匹配：
- 與Bruker MBT庫比對(duì)→Score≥2.0為可靠鑒定。

三、關(guān)鍵設(shè)備與數(shù)據(jù)庫

設(shè)備/工具	用途	推薦型號(hào)/品牌
實(shí)時(shí)熒光PCR儀	耐藥基因快速篩查（qPCR）	Bio-Rad CFX96 Touch™（多重檢測）
全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)	臨床菌株高通量鑒定（VITEK 2）	bioMérieux VITEK 2 Compact
高通量測序平臺(tái)	全基因組/宏基因組分析	Illumina NovaSeq 6000（PE150）
MALDI-TOF質(zhì)譜儀	蛋白指紋圖譜鑒定（種水平）	Bruker MALDI Biotyper sirius
生物信息學(xué)軟件	序列拼接與注釋（CLC/WGS）	CLC Genomics Workbench、antiSMASH

四、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	改進(jìn)措施
測序結(jié)果混雜	DNA污染或引物非特異性擴(kuò)增	重新純化DNA，設(shè)計(jì)特異性引物（如V3-V4區(qū)）
MALDI鑒定失敗	蛋白提取不足或數(shù)據(jù)庫不全	優(yōu)化裂解步驟（超聲處理），更新質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫
生化反應(yīng)不明確	菌株代謝惰性或培養(yǎng)基失效	延長培養(yǎng)時(shí)間（至72h），更換新鮮試劑條
耐藥表型-基因不符	基因沉默或新突變未收錄	驗(yàn)證基因表達(dá)（RT-PCR），提交新突變至CARD數(shù)據(jù)庫

五、國際標(biāo)準(zhǔn)與數(shù)據(jù)庫

參數(shù)	中國標(biāo)準(zhǔn)	國際標(biāo)準(zhǔn)（CLSI/ISO）	主流數(shù)據(jù)庫
16S rRNA相似度	≥99%（種水平）	≥98.7%（種水平，EzBioCloud）	NCBI GenBank、RDP
MALDI鑒定閾值	Score≥2.0（種級(jí)）	Score≥2.3（種級(jí)，Bruker標(biāo)準(zhǔn)）	Bruker MBT、VITEK MS RUO
耐藥基因分析	參照CLSI M100	CLSI M35-A2（藥敏試驗(yàn)）	CARD、ARDB

六、應(yīng)用場景與建議

臨床診斷：
- 優(yōu)先使用 MALDI-TOF MS 或 VITEK 2 實(shí)現(xiàn)快速鑒定（2~4h），結(jié)合藥敏試驗(yàn)（KB法/MIC）；
- 多重耐藥菌（如MRSA）需加測 mecA/PBP2a。
環(huán)境微生物：
- 采用 宏基因組測序 分析菌群多樣性，結(jié)合 antiSMASH 挖掘功能基因；
- 極端環(huán)境菌種需 富集培養(yǎng)（如高溫/高鹽培養(yǎng)基）。
工業(yè)菌株優(yōu)化：
- 全基因組測序 篩選高產(chǎn)突變株，通過 CRISPR-Cas9 編輯目標(biāo)基因。

七、報(bào)告與認(rèn)證

報(bào)告內(nèi)容：
- 菌株來源、鑒定方法（形態(tài)/分子/質(zhì)譜）、相似度/置信度、功能基因注釋；
- 附序列登錄號(hào)（如GenBank ID）及原始數(shù)據(jù)（FASTQ文件）。
認(rèn)證要求：
- 臨床菌株：需通過 CAP/ISO 15189 認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室出具報(bào)告；
- 工業(yè)菌種保藏：提交至 CGMCC/ATCC 獲取保藏編號(hào)。

通過系統(tǒng)化鑒定，可精準(zhǔn)解析菌株分類地位、功能特性及潛在應(yīng)用價(jià)值。建議根據(jù)需求選擇 “快（MALDI）-準(zhǔn)（WGS）-穩(wěn)（生化）” 組合策略，并定期更新數(shù)據(jù)庫與實(shí)驗(yàn)質(zhì)控（如陽性對(duì)照株 E. coli ATCC 25922）。