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滅活疫苗中的內(nèi)毒素（Endotoxin）檢測

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發(fā)布時間：2025-03-12 10:01:56 更新時間：2025-03-11 10:04:05

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

滅活疫苗中的內(nèi)毒素（Endotoxin）檢測是確保疫苗安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)毒素（即脂多糖，LPS）主要來源于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁，具有強(qiáng)致熱性，需通過高靈敏度方法檢測并嚴(yán)格控制殘留量。以下是基于《中國藥典》2020版和美國藥典（USP）<85>的檢測方案與操作指南：

一、核心檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)

檢測方法	原理	適用場景	檢測限（靈敏度）
鱟試劑凝膠法（Gel Clot）	內(nèi)毒素與鱟血細(xì)胞裂解物反應(yīng)形成凝膠	定性/半定量篩查	0.03~0.25 EU/mL
動態(tài)濁度法（Turbidimetric）	內(nèi)毒素濃度與濁度變化速率呈正比	高精度定量（廣譜適用）	0.001~10 EU/mL
顯色基質(zhì)法（Chromogenic）	內(nèi)毒素激活酶促反應(yīng)，釋放黃色對硝基苯胺（pNA）	高靈敏度定量（抗干擾強(qiáng)）	0.005~50 EU/mL
重組C因子法（rFC）	重組C因子替代鱟血試劑，避免動物源性污染	環(huán)保/替代傳統(tǒng)方法	0.005~10 EU/mL

相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：

中國藥典：注射劑內(nèi)毒素限值≤5 EU/(kg·h)，疫苗按劑量折算（如0.5 mL/劑，限值≤10 EU/劑）。
USP <85>：內(nèi)毒素檢測需通過方法驗證（包括干擾試驗）。

二、檢測流程（以動態(tài)濁度法為例）

樣品預(yù)處理：
- 滅活疫苗：根據(jù)配方調(diào)整pH（6.0~8.0），必要時稀釋（稀釋液需驗證無內(nèi)毒素干擾）。
- 陽性對照：使用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE，內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品）。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：
- 配制系列濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（如0.01、0.1、1、10 EU/mL）。
干擾試驗：
- 驗證疫苗成分（如佐劑、防腐劑）對檢測無抑制或增強(qiáng)作用。
檢測操作：
- 將樣品與鱟試劑混合，37℃孵育，實(shí)時監(jiān)測濁度變化速率。
- 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算內(nèi)毒素含量（EU/mL）。
結(jié)果判定：
- 合格標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素含量≤藥典規(guī)定限值（如≤10 EU/劑）。

三、關(guān)鍵設(shè)備與試劑

設(shè)備/試劑	用途	推薦型號/品牌
內(nèi)毒素檢測儀	動態(tài)濁度/顯色法實(shí)時監(jiān)測	Endosafe Nexgen（Charles River）
鱟試劑（LAL）	內(nèi)毒素特異性反應(yīng)試劑	PyroGene（Lonza）
無熱原耗材	避免實(shí)驗污染（吸頭、試管等）	Thermo Scientific™ Nunc™
標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）	定量校準(zhǔn)與陽性對照	USP Endotoxin Reference Standard

四、常見問題與解決方案

問題	原因分析	優(yōu)化措施
假陽性結(jié)果	實(shí)驗器具或試劑污染	使用無熱原耗材，規(guī)范操作流程
假陰性結(jié)果	樣品中存在干擾物質(zhì)（如β-葡聚糖）	增加稀釋倍數(shù)或改用顯色基質(zhì)法
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差	鱟試劑批次差異或保存不當(dāng)	使用同一批次試劑，嚴(yán)格-20℃保存
檢測限不達(dá)標(biāo)	樣品初始內(nèi)毒素含量過低	濃縮樣品或換用高靈敏度方法（如rFC法）

五、應(yīng)用場景與檢測建議

疫苗生產(chǎn)中間品監(jiān)控：
- 檢測節(jié)點(diǎn)：滅活后、純化前、成品灌裝前。
- 限值控制：中間品內(nèi)毒素≤50 EU/mL（依工藝調(diào)整）。
疫苗成品放行：
- 必檢項：按藥典標(biāo)準(zhǔn)全項檢測（包括內(nèi)毒素、無菌、效力等）。
原材料篩查：
- 關(guān)鍵點(diǎn)：培養(yǎng)基、緩沖液、佐劑的內(nèi)毒素檢測（限值≤0.25 EU/mL）。