滅活疫苗中的內(nèi)毒素（Endotoxin）檢測是確保疫苗安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)毒素（即脂多糖，LPS）主要來源于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁，具有強(qiáng)致熱性，需通過高靈敏度方法檢測并嚴(yán)格控制殘留量。以下是基于《中國藥典》2020版和美國藥典（USP）<85>的檢測方案與操作指南：
一、核心檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)
| 檢測方法 |
原理 |
適用場景 |
檢測限（靈敏度） |
| 鱟試劑凝膠法（Gel Clot） |
內(nèi)毒素與鱟血細(xì)胞裂解物反應(yīng)形成凝膠 |
定性/半定量篩查 |
0.03~0.25 EU/mL |
| 動態(tài)濁度法（Turbidimetric） |
內(nèi)毒素濃度與濁度變化速率呈正比 |
高精度定量（廣譜適用） |
0.001~10 EU/mL |
| 顯色基質(zhì)法（Chromogenic） |
內(nèi)毒素激活酶促反應(yīng)，釋放黃色對硝基苯胺（pNA） |
高靈敏度定量（抗干擾強(qiáng)） |
0.005~50 EU/mL |
| 重組C因子法（rFC） |
重組C因子替代鱟血試劑，避免動物源性污染 |
環(huán)保/替代傳統(tǒng)方法 |
0.005~10 EU/mL |
相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：
- 中國藥典：注射劑內(nèi)毒素限值≤5 EU/(kg·h)，疫苗按劑量折算（如0.5 mL/劑，限值≤10 EU/劑）。
- USP <85>：內(nèi)毒素檢測需通過方法驗證（包括干擾試驗）。
二、檢測流程（以動態(tài)濁度法為例）
-
樣品預(yù)處理：
- 滅活疫苗：根據(jù)配方調(diào)整pH（6.0~8.0），必要時稀釋（稀釋液需驗證無內(nèi)毒素干擾）。
- 陽性對照：使用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE，內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品）。
-
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：
- 配制系列濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（如0.01、0.1、1、10 EU/mL）。
-
干擾試驗：
- 驗證疫苗成分（如佐劑、防腐劑）對檢測無抑制或增強(qiáng)作用。
-
檢測操作：
- 將樣品與鱟試劑混合，37℃孵育，實(shí)時監(jiān)測濁度變化速率。
- 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算內(nèi)毒素含量（EU/mL）。
-
結(jié)果判定：
- 合格標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素含量≤藥典規(guī)定限值（如≤10 EU/劑）。
三、關(guān)鍵設(shè)備與試劑
| 設(shè)備/試劑 |
用途 |
推薦型號/品牌 |
| 內(nèi)毒素檢測儀 |
動態(tài)濁度/顯色法實(shí)時監(jiān)測 |
Endosafe Nexgen（Charles River） |
| 鱟試劑（LAL） |
內(nèi)毒素特異性反應(yīng)試劑 |
PyroGene（Lonza） |
| 無熱原耗材 |
避免實(shí)驗污染（吸頭、試管等） |
Thermo Scientific™ Nunc™ |
| 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE） |
定量校準(zhǔn)與陽性對照 |
USP Endotoxin Reference Standard |
四、常見問題與解決方案
| 問題 |
原因分析 |
優(yōu)化措施 |
| 假陽性結(jié)果 |
實(shí)驗器具或試劑污染 |
使用無熱原耗材，規(guī)范操作流程 |
| 假陰性結(jié)果 |
樣品中存在干擾物質(zhì)（如β-葡聚糖） |
增加稀釋倍數(shù)或改用顯色基質(zhì)法 |
| 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差 |
鱟試劑批次差異或保存不當(dāng) |
使用同一批次試劑，嚴(yán)格-20℃保存 |
| 檢測限不達(dá)標(biāo) |
樣品初始內(nèi)毒素含量過低 |
濃縮樣品或換用高靈敏度方法（如rFC法） |
五、應(yīng)用場景與檢測建議
-
疫苗生產(chǎn)中間品監(jiān)控：
- 檢測節(jié)點(diǎn)：滅活后、純化前、成品灌裝前。
- 限值控制：中間品內(nèi)毒素≤50 EU/mL（依工藝調(diào)整）。
-
疫苗成品放行：
- 必檢項：按藥典標(biāo)準(zhǔn)全項檢測（包括內(nèi)毒素、無菌、效力等）。
-
原材料篩查：
- 關(guān)鍵點(diǎn)：培養(yǎng)基、緩沖液、佐劑的內(nèi)毒素檢測（限值≤0.25 EU/mL）。
六、替代方法：重組C因子法（rFC）優(yōu)勢
- 環(huán)保性：無需依賴鱟血，保護(hù)生態(tài)。
- 抗干擾：不受（1,3）-β-D-葡聚糖干擾。
- 標(biāo)準(zhǔn)化：符合EP 2.6.32和USP <85>。
通過規(guī)范化的內(nèi)毒素檢測，可有效保障滅活疫苗的安全性。建議結(jié)合生產(chǎn)工藝優(yōu)化（如超濾、層析純化）降低內(nèi)毒素殘留，并定期驗證檢測方法的適用性。
CMA認(rèn)證
檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實(shí)驗室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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