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熒光定量PCR檢測

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發(fā)布時間：2025-03-06 10:13:21 更新時間：2025-03-05 10:14:57

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

一、檢測核心原理與定義

熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qPCR）是一種通過 實(shí)時監(jiān)測熒光信號 來定量核酸（DNA/cDNA）的技術(shù)，其核心原理包括：

熒光化學(xué)機(jī)制：
- TaqMan探針法：探針5'端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)（如FAM），3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)（如BHQ）。PCR擴(kuò)增時，Taq酶切割探針，釋放熒光信號。
- SYBR Green法：SYBR Green染料結(jié)合雙鏈DNA后發(fā)出熒光，信號強(qiáng)度與產(chǎn)物量成正比。
定量原理：通過閾值循環(huán)數(shù)（Ct值，熒光信號超過背景閾值的循環(huán)數(shù)）與初始模板量的對數(shù)關(guān)系進(jìn)行定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法或ΔΔCt法）。

二、檢測流程與操作規(guī)范

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

步驟	操作要點(diǎn)
引物/探針設(shè)計	引物Tm值58-62℃，產(chǎn)物長度80-200bp；探針Tm比引物高5-10℃，避免二級結(jié)構(gòu)（使用Primer-BLAST驗(yàn)證）。
樣本處理	DNA/RNA提取（如Qiagen試劑盒），測定濃度與純度（A260/A280：1.8-2.0）。
反應(yīng)體系配置	按試劑盒說明配制（常見體系20μL：模板2μL，引物各0.5μM，探針0.2μM，Master Mix 10μL）。

2. 反應(yīng)程序設(shè)置

階段	溫度與時間	目的
預(yù)變性	95℃, 5-10min	激活DNA聚合酶，模板完全變性。
擴(kuò)增循環(huán)（40-45次）	95℃ 15s → 60℃ 30s（采集熒光）	變性、退火、延伸與信號采集。
熔解曲線（SYBR Green法）	95℃ 15s → 60℃ 1min → 95℃ 15s（緩慢升溫）	驗(yàn)證產(chǎn)物特異性。

3. 數(shù)據(jù)分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線法：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立Ct值與log拷貝數(shù)的線性關(guān)系（R²≥0.99），計算未知樣本濃度。
ΔΔCt法（相對定量）：以內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin）為基準(zhǔn)，計算目標(biāo)基因表達(dá)倍數(shù)變化（2^-ΔΔCt）。
熔解曲線分析：單一峰表示特異性擴(kuò)增；多峰提示引物二聚體或非特異性產(chǎn)物。

三、核心檢測項(xiàng)目與應(yīng)用領(lǐng)域

1. 醫(yī)學(xué)診斷

應(yīng)用場景	檢測目標(biāo)	示例
病原體檢測	病毒（如SARS-CoV-2、HPV）、細(xì)菌（如結(jié)核分枝桿菌）	新冠病毒核酸試劑盒（TaqMan探針法）。
基因表達(dá)分析	mRNA水平（如癌癥標(biāo)志物HER2、EGFR）	乳腺癌HER2表達(dá)定量。
基因分型	SNP、突變（如EGFR T790M）	肺癌靶向治療突變篩查。

2. 農(nóng)業(yè)與食品安全

應(yīng)用場景	檢測目標(biāo)	示例
轉(zhuǎn)基因檢測	外源基因（如CaMV 35S啟動子）	大豆轉(zhuǎn)基因成分篩查。
食源性致病菌	沙門氏菌、李斯特菌	食品中沙門氏菌定量檢測。

3. 科研應(yīng)用

應(yīng)用場景	檢測目標(biāo)	示例
microRNA定量	微小RNA（如miR-21）	腫瘤細(xì)胞miRNA表達(dá)譜分析。
病毒載量監(jiān)測	HIV、HBV DNA定量	艾滋病患者抗病毒療效評估。

四、常見問題與解決方案

1. 擴(kuò)增效率低（標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率≠-3.32）

可能原因	解決方案
引物設(shè)計不佳	重新設(shè)計引物，避免二聚體及二級結(jié)構(gòu)（使用OligoAnalyzer驗(yàn)證）。
模板質(zhì)量差	重新提取DNA/RNA，確保A260/A280在1.8-2.0之間。
抑制劑殘留	稀釋模板或使用抑制劑去除試劑盒（如Zymo DNA Clean & Concentrator）。

2. 非特異性擴(kuò)增（熔解曲線多峰）

可能原因	解決方案
退火溫度過低	優(yōu)化退火溫度（梯度PCR確定最佳Tm）。
引物濃度過高	降低引物濃度（0.1-0.3μM）。
模板過量	稀釋模板至合適濃度（通常1-100ng/μL）。

3. 無擴(kuò)增信號（Ct值≥40）

可能原因	解決方案
模板降解	檢測RNA完整性（如Agilent 2100 Bioanalyzer，RIN≥7）。
引物/探針失效	驗(yàn)證引物/探針活性（陽性對照測試）。
儀器通道設(shè)置錯誤	檢查熒光通道是否與探針標(biāo)記匹配（如FAM對應(yīng)HEX通道錯誤）。

五、質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化

1. 實(shí)驗(yàn)對照設(shè)置

對照類型	目的
陰性對照	無模板對照（NTC）：排除污染與非特異性擴(kuò)增。
陽性對照	已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品：驗(yàn)證反應(yīng)體系有效性。
內(nèi)參基因	管家基因（如GAPDH、18S rRNA）：校正樣本間RNA/DNA質(zhì)量差異。

2. 標(biāo)準(zhǔn)化指南

MIQE指南（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）：要求報告引物序列、擴(kuò)增效率、內(nèi)參基因等信息。
ISO 20395：核酸檢測的靈敏度和特異性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

六、設(shè)備與試劑推薦

1. 核心設(shè)備

設(shè)備類型	推薦型號	特點(diǎn)
qPCR儀	Applied Biosystems QuantStudio 5	支持多色熒光（5通道），快速升降溫。
	Bio-Rad CFX96 Touch	觸摸屏操作，熔解曲線分析精準(zhǔn)。
核酸定量儀	Thermo NanoDrop One	微量樣本檢測（1μL），快速測定純度。

2. 常用試劑

試劑類型	推薦品牌	特點(diǎn)
TaqMan探針預(yù)混液	Thermo Fisher TaqMan Fast Advanced	擴(kuò)增速度快（40分鐘完成45循環(huán)）。
SYBR Green預(yù)混液	Takara SYBR Premix Ex Taq	高靈敏度，兼容多種樣本類型。

七、技術(shù)前沿與創(chuàng)新方向

數(shù)字PCR（dPCR）：絕對定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度達(dá)單拷貝級別。
多重qPCR：多色熒光同時檢測多個靶標(biāo)（如Bio-Rad HEX/FAM/Cy5通道）。
自動化整合：全自動核酸提取與qPCR聯(lián)用（如Roche Cobas 6800系統(tǒng)）。
便攜式qPCR儀：現(xiàn)場快速檢測（如BioFire FilmArray）。

通過規(guī)范化的熒光定量PCR檢測，可精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn) 核酸定量、 基因表達(dá)分析 及 病原體診斷，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、科研與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。建議實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格遵循 MIQE指南，優(yōu)化引物設(shè)計，并定期校準(zhǔn)設(shè)備以確保數(shù)據(jù)可靠性。