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細(xì)胞凋亡檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2024-05-21 08:15:32 更新時(shí)間：2025-05-13 17:35:09

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)的過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。

凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)多種細(xì)胞凋亡的過程有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識(shí)，但是迄今為止凋亡過程確切的機(jī)制尚不完全清楚。凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，如腫瘤和自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。

技術(shù)原理

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。

碘化丙啶(Propidium，簡稱PI)是一種雙鏈DNA熒光染料。PI和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被PI染色后，可用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。PI染色后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化(DNA fragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA片段在染色過程中丟失，因此凋亡細(xì)胞在PI染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強(qiáng)度小于1，在流式檢測(cè)的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細(xì)胞峰。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮，核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞對(duì)前向角光散射的能力顯著降低，對(duì)側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細(xì)胞凋亡晚期，前向和側(cè)向光散射的信號(hào)均降低。因此可通過流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。