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干熱滅菌生物監(jiān)測方法檢測

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發(fā)布時間：2025-08-02 02:35:39 更新時間：2025-08-01 02:35:39

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

干熱滅菌生物監(jiān)測方法

干熱滅菌是一種利用高溫（通常在160°C至190°C范圍內(nèi)）和干燥空氣進(jìn)行滅菌的方法，主要適用于不耐濕熱或易被蒸汽破壞的物品，如玻璃器皿、金屬器械、粉末、油劑、凡士林和某些熱穩(wěn)定性強(qiáng)的材料。其滅菌原理是通過熱空氣的氧化作用破壞微生物的蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到殺滅所有微生物（包括細(xì)菌芽孢）的目的。干熱滅菌過程的驗(yàn)證至關(guān)重要，而生物監(jiān)測是其關(guān)鍵組成部分，用于直接挑戰(zhàn)滅菌過程的殺滅微生物能力，提供過程有效性的最直接證據(jù)。生物監(jiān)測利用對干熱具有高度抵抗力的標(biāo)準(zhǔn)生物指示劑，模擬滅菌過程對最難殺滅微生物的實(shí)際效果。

檢測項(xiàng)目

干熱滅菌生物監(jiān)測的核心檢測項(xiàng)目是：確定滅菌過程對標(biāo)準(zhǔn)生物指示劑（枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢）的殺滅能力是否達(dá)到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)要求。具體目標(biāo)是確認(rèn)在特定的溫度和時間參數(shù)下，滅菌后生物指示劑載體上的芽孢是否全部被殺滅，即是否達(dá)到無菌保證水平。

檢測儀器

進(jìn)行干熱滅菌生物監(jiān)測需要以下主要儀器和設(shè)備：

標(biāo)準(zhǔn)生物指示劑： 含有特定數(shù)量（通常 ≥ 1.0 × 10? CFU）的枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus atrophaeus, 原稱 Bacillus subtilis var. niger）芽孢的載體（如菌片）。該菌種對干熱具有公認(rèn)最強(qiáng)的抵抗力。
干熱滅菌柜/烘箱： 性能經(jīng)過驗(yàn)證，能提供均勻、穩(wěn)定的設(shè)定溫度和時間的設(shè)備。
生物指示劑專用載體架/挑戰(zhàn)裝置： 用于將生物指示劑放置于滅菌柜內(nèi)預(yù)先確定的最難滅菌位置（通常為冷點(diǎn)附近或代表性負(fù)載中）。
無菌操作工具： 無菌鑷子、手套、酒精棉等，用于在無菌條件下取出和處理滅菌后的生物指示劑。
微生物培養(yǎng)箱： 能精確控制在30-35°C的培養(yǎng)設(shè)備，用于培養(yǎng)生物指示劑。
培養(yǎng)基： 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）或指定的專用培養(yǎng)基，用于復(fù)蘇和培養(yǎng)可能存活的芽孢。
陽性對照生物指示劑： 與試驗(yàn)指示劑同批次，但不經(jīng)過滅菌處理，用于驗(yàn)證培養(yǎng)基的促生長能力。
陰性對照： 未接種的培養(yǎng)基，用于驗(yàn)證培養(yǎng)基的無菌性。

檢測方法

干熱滅菌生物監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)方法步驟如下：

指示劑布點(diǎn)： 根據(jù)驗(yàn)證方案要求，將適量（通常每滅菌周期至少使用一個，但驗(yàn)證時需多點(diǎn)布放）生物指示劑放入專用載體架或挑戰(zhàn)裝置內(nèi)，并放置于滅菌柜內(nèi)預(yù)先確認(rèn)的“冷點(diǎn)”或代表性負(fù)載中最難滅菌的位置。
滅菌運(yùn)行： 按照既定的滅菌程序運(yùn)行干熱滅菌柜，確保溫度和時間參數(shù)達(dá)到設(shè)定要求。
指示劑取出與轉(zhuǎn)移： 滅菌程序結(jié)束后，待滅菌柜溫度降至安全范圍（通?！?0°C），在無菌條件下，用無菌工具迅速將生物指示劑從柜內(nèi)取出。
培養(yǎng)前處理： 根據(jù)生物指示劑說明書，可能需要在無菌條件下將菌片（或其他載體）轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的試管中（自含式生物指示劑則直接培養(yǎng)）。
培養(yǎng)： 將接種后的培養(yǎng)基試管或自含式指示劑放入30-35°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時間通常為48小時。
陽性與陰性對照： 同時培養(yǎng)陽性對照（同批號未滅菌的指示劑）和陰性對照（未接種培養(yǎng)基）。
結(jié)果判讀：
- 觀察：在培養(yǎng)結(jié)束后（如48小時），肉眼或借助儀器（如比濁儀）觀察培養(yǎng)基試管或自含式指示劑的顏色變化（如溴甲酚紫指示劑由紫色變黃色）。
- 陽性對照：必須顯示生長（如培養(yǎng)基變渾濁或顏色變化），證明培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件能支持芽孢生長。
- 陰性對照：必須無生長（培養(yǎng)基保持澄清或顏色不變），證明培養(yǎng)基無菌。
- 測試指示劑：如果所有測試的生物指示劑均無生長（無渾濁、無顏色變化），則結(jié)果為陰性，表明滅菌過程有效。如果任何一個測試指示劑顯示生長（渾濁或顏色變化），則結(jié)果為陽性，表明滅菌過程失敗。
記錄與報告： 詳細(xì)記錄滅菌參數(shù)（溫度、時間）、指示劑布點(diǎn)位置、批號、培養(yǎng)條件、觀察時間和結(jié)果判讀情況。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

干熱滅菌生物監(jiān)測需遵循嚴(yán)格的國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，主要包括：

《中華人民共和國藥典》（ChP）: 通則1421滅菌法對干熱滅菌及其生物監(jiān)測有明確規(guī)定。要求使用枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢作為生物指示劑，其存活時間（存活曲線法測定）和殺滅時間（部分陰性法測定）需符合要求。
ISO 11138-3:2017 Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 3: Biological indicators for moist heat sterilization: 該標(biāo)準(zhǔn)雖主要針對濕熱，但其對生物指示劑生產(chǎn)、性能測試（如D值、Z值、存活時間和殺滅時間）和抗力檢測的方法原理在干熱生物指示劑評估中具有重要參考價值。嚴(yán)格來說，干熱生物指示劑應(yīng)參照類似原則。
行業(yè)規(guī)范與驗(yàn)證指南： 各國藥品GMP、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范、相關(guān)行業(yè)指南（如PDA TR #3, ISPE指南等）對滅菌工藝驗(yàn)證（包括生物監(jiān)測）提出了具體要求。
產(chǎn)品說明書： 生物指示劑制造商提供的產(chǎn)品說明書規(guī)定了具體的使用、培養(yǎng)和判讀方法，是操作的重要依據(jù)。

核心要求： 生物監(jiān)測必須證明，在設(shè)定的滅菌條件下，對枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢的殺滅能達(dá)到不低于6-log的殺滅率（即存活概率≤10??），以證明滅菌過程的有效性。這通常通過殺滅時間（T值）或存活曲線/部分陰性法來驗(yàn)證。日常監(jiān)測則主要看生物指示劑培養(yǎng)結(jié)果是否為陰性。