SD大鼠

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.

3.1.2實驗儀器

3.1.3實驗試劑

3.1.4模型構(gòu)建流程

利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行條件性敲除（Conditional knockout，CKO），制備心肌組織特異性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外顯子兩端插入兩個loxP位點來構(gòu)建Isca1^flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進(jìn)行雜交，經(jīng)兩輪雜交最終獲得Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定，使用Western blot技術(shù)進(jìn)行敲除效率的鑒定。

3.1.5 Isca1條件性敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的建立

3.1.5.1 Isca1條件性敲除大鼠模型的建立

1. 
   設(shè)計方案

圖 1. Isca1條件性敲除模型構(gòu)建設(shè)計方案

2. 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據(jù)基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT   GGG

R-ISCA1-gRNA UP1        5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-ISCA1-gRNA DOWN1    5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶點2:

AGCCCTGAACTCCTTATG   TGG

R-ISCA1-gRNA UP2        5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-ISCA1-gRNA DOWN2    5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

3. 合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
4. 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
5. 顯微注射

1. 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進(jìn)行超排。
2. 受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。
3. 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。
4. 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5. 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

6. 基因型鑒定

1. 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。
2. 基因組DNA提?。菏褂没蚪MDNA提取試劑盒提取基因組DNA
3. PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計檢測引物并進(jìn)行PCR檢測。

7. 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
8. 根據(jù)測序結(jié)果確定Isca1條件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。

3.1.5.2 心肌組織特異性Isca1敲除大鼠（Isca1^flox/flox/MHC-Cre）的建立

根據(jù)3.1.5.1獲得Isca1^flox/+大鼠F1代后，首先通過8周齡左右Isca1^flox/+與野生型大鼠進(jìn)行雜交，獲得一定數(shù)量的Isca1^flox/+大鼠。與此同時使8周齡左右Isca1^flox/+大鼠與αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進(jìn)行雜交，得到Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周齡左右Isca1^flox/+大鼠與Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠進(jìn)行第二輪雜交，可得到Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌組織特異性Isca1敲除純合子大鼠，用于后續(xù)實驗。

圖 2. Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。

1. 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
2. 12000 rpm 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。
3. 加入500 μLBB2，立即渦旋5 s，室溫孵育10 min。
4. 將全部的溶液加入離心柱中，8000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
5. 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
6. 重復(fù)步驟（5）一次。
7. 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000 rpm 離心1 min，棄掉流出液。
8. 重復(fù)步驟（7）一次。
9. 10000 rpm 離心2 min，徹底去除殘留的WB2。

將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5 min，在柱的中央加入50~200 μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3 min，12000 rpm 離心2 min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。