3.1 實驗材料
3.1.1 實驗動物
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。超排用雌鼠數(shù)量10-15只，年齡3周齡，交配傳代用野生型SD大鼠為成年8-10周齡大鼠。實驗中基因工程大鼠由本實驗室繁殖產(chǎn)生。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
3.1.2實驗儀器
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儀器及耗材
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生產(chǎn)廠商
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NanoZoomer S60數(shù)字病理切片掃描儀
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日本濱松光子學株式會社
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激光共聚焦掃描顯微鏡
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Leica
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透射電子顯微鏡
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JEOL
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顯微注射儀
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Nikon
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光學顯微鏡
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Nikon
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化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)
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BIO-RAD
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PCR儀
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BIO-RAD
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Realtime PCR儀
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ABI
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冰凍切片機
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Leica
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電泳儀
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BIO-RAD
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電泳槽
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Tanon
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數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)
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Tanon
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組織勻漿機
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POLYTRON
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恒溫培養(yǎng)箱
溫控振蕩箱
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Incucell
TAITEC
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離心機
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Eppendorf
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搖床
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SCILOGEX
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塑料薄膜封口機
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德清拜杰有限公司
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電動鼓風干燥箱
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天津市泰斯特儀器有限公司
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電子稱量器（量程0.5g-620g）
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奧豪斯儀器（常州）有限公司
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電子稱量器（量程0.1mg-220g）
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Sartorius
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4℃冰箱
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海爾集團
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-80℃冰箱
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SANYO
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-20℃冰箱
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SANYO
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渦旋振蕩器
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上海滬西分析儀器廠
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移液器
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Eppendorf
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MRI
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西門子
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PET/CT
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西門子
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3.1.3實驗試劑
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試劑
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生產(chǎn)廠商
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體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒
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Ambion
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Taq DNA聚合酶
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TaKaRa
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T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒
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Invitrogen
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T4 DNA裂連接
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TaKaRa
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膠回收試劑盒
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Qiagen
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質(zhì)粒提取試劑盒
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Axygen
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Trizol試劑
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Invitrogen
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逆轉(zhuǎn)錄試劑盒
DNA提取試劑盒
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Invitrogen
北京全式金生物科技有限公司
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MBP（MAB42282）抗體
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R&D
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GADPH
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Santa Cruz Biotechnology
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NC膜
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Millipore
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化學發(fā)光液
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Immuno Cruz
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蛋白質(zhì)分子量標記物
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Takara
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蛋白酶抑制劑
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羅氏
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組織裂解液
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Thermo
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麗春紅
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Beyotime
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BCA試劑盒
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Beyotime
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Western blot 洗液（10×）
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Beyotime
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30%Acr-Bis
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Beyotime
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SDS-PAGE電泳液
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Beyotime
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Western blot轉(zhuǎn)膜液（粉劑）
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Beyotime
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TEMED
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Beyotime
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過硫酸銨
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Beyotime
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1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）緩沖液
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Beyotime
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1 M Tris·HCl（pH=6.8）緩沖液
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Beyotime
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瓊脂
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BD公司
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異丙醇
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北京化工廠
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脫脂奶粉
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內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司
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3.1.4模型構建流程
利用CRISPR/Cas9技術制備MBP敲除大鼠。在MBP基因起始密碼子之前插入Cre重組酶，來構建MBP-Cre大鼠(SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS)。該模型與Cre 報告大鼠進行雜交(SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS)，可以檢測MBP基因的表達圖譜，同時通過雜合子交配的方式可以獲得該基因敲除的純合子大鼠，使用PCR方法進行基因型鑒定，使用Western blot技術進行蛋白水平敲除效率的鑒定。
3.1.5 MBP-Cre大鼠的建立
3.1.5.1 MBP-Cre大鼠模型的建立
- 設計方案
圖 1. MBP-Cre大鼠模型構建設計方案
- 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據(jù)基因信息選擇靶點并合成sgRNA。
靶點1:
R-Mbp-EA-gRNAup: TAGGTGCCCACCCAGCTGACCC
R- Mbp-EA-gRNAdown: AAACGGGTCAGCTGGGTGGGCA
GGCGCTTCTTTAGCGGTGAC AGG
R-Mbp-EB-gRNAup: TAGGCGCTTCTTTAGCGGTGAC
R- Mbp-EB-gRNAdown: AAACGTCACCGCTAAAGAAGCG
合成的sgRNA單鏈通過退火復性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
- 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
- 顯微注射
- 超數(shù)排卵：10-15只3周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
- 受精卵注射：取約120枚受精卵進行注射。
- 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
- 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，5只受體鼠）。
- 基因型鑒定
- 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
- 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
- PCR檢測：根據(jù)序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。
- 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
- 根據(jù)測序結(jié)果確定MBP-Cre模型大鼠（SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。
3.1.5.2 動物繁殖和表達圖譜分析
獲得F0代后，首先通過與野生型大鼠進行雜交，進行基因修飾大鼠傳代能力分析。該模型包含Cre重組酶，可以同時與Cre reporter大鼠（SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進行雜交，得到imCherry/MHC-Cre大鼠，進行表達圖譜分析。之后MBP-Cre大鼠通過雜合子與雜合子雜交，獲得MBP-Cre純合子大鼠，進行蛋白表達分析，并用于后續(xù)實驗。
圖 2. MBP-Cre大鼠的繁育
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒（全式金）說明書按以下程序操作。
- 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
- 12000 rpm 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。
- 加入500 μLBB2，立即渦旋5 s，室溫孵育10 min。
- 將全部的溶液加入離心柱中，8000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 重復步驟（5）一次。
- 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000 rpm 離心1 min，棄掉流出液。
- 重復步驟（7）一次。
- 10000 rpm 離心2 min，徹底去除殘留的WB2。
- 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5 min，在柱的中央加入50~200 μL預熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3 min，12000 rpm 離心2 min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
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