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C9ORF72基因HRE敲入大鼠模型

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發(fā)布時間：2024-05-21 08:15:32 更新時間：2025-02-18 14:34:33

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資源中文名稱

C9ORF72基因HRE敲入大鼠

資源英文名稱

C9ORF72 HRE knock in rat

疾病概述

　　肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）也叫運動神經(jīng)元?。∕ND），后一名稱英國常用，法國又叫夏科（Charcot）病，而美國也稱盧伽雷（Lou Gehrig）病。我國通常將肌萎縮側(cè)索硬化和運動神經(jīng)元病混用。它是上運動神經(jīng)元和下運動神經(jīng)元損傷之后，導致包括球部（所謂球部，就是指的是延髓支配的這部分肌肉）、四肢、軀干、胸部腹部的肌肉逐漸無力和萎縮?；疾÷始s為4-6/10萬。大約10%的ALS病例是家族型的，90%是散發(fā)型的。　　2018年5月11日，國家衛(wèi)生健康委員會等5部門聯(lián)合制定了《第一批罕見病目錄》，肌萎縮側(cè)索硬化被收錄其中。

實驗動物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.

3.1.2實驗儀器

儀器及耗材	生產(chǎn)廠商
NanoZoomer S60數(shù)字病理切片掃描儀	日本濱松光子學株式會社
Vevo770小動物超聲影像系統(tǒng)	VisualSonics
激光共聚焦掃描顯微鏡	Leica
透射電子顯微鏡	JEOL
顯微注射儀	Nikon
光學顯微鏡	Nikon
化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)	BIO-RAD
PCR儀	BIO-RAD
組織脫水機	Leica
石蠟切片機	Leica
石蠟包埋機	Leica
冰凍切片機	Leica
電泳儀	BIO-RAD
電泳槽	Tanon
數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)	Tanon
組織勻漿機	POLYTRON
恒溫培養(yǎng)箱溫控振蕩箱	Incucell TAITEC
離心機	Eppendorf
搖床	SCILOGEX
塑料薄膜封口機	德清拜杰有限公司
電動鼓風干燥箱	天津市泰斯特儀器有限公司
電子稱量器（量程0.5g-620g）	奧豪斯儀器（常州）有限公司
電子稱量器（量程0.1mg-220g）	Sartorius
4℃冰箱	海爾集團
-80℃冰箱	SANYO
-20℃冰箱	SANYO
渦旋振蕩器	上海滬西分析儀器廠
移液器	Eppendorf

3.1.3實驗試劑

試劑	生產(chǎn)廠商
體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒	Ambion
Taq DNA聚合酶	TaKaRa
T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒	Invitrogen
T4 DNA裂連接	TaKaRa
膠回收試劑盒	Qiagen
質(zhì)粒提取試劑盒	Axygen
Trizol試劑	Invitrogen
逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 DNA提取試劑盒	Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司
C9orf72（66140-1-lg）抗體	proteintech
Purified Mouse Anti-GM130（610822）	BD
Anti-Giantin antibody (ab37266)	Abcam
Anti-Rab5 antibody (ab18211)	Abcam
Anti-RAB7 antibody (ab137029 )	Abcam
Anti-Rab11 antibody (ab3612)	Abcam
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 （A11029 ）	Invitrogen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A21424 ）	Invitrogen
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A31572）	Invitrogene
GADPH	Santa Cruz Biotechnology
NC膜	Millipore
化學發(fā)光液	Immuno Cruz
蛋白質(zhì)分子量標記物	Takara
蛋白酶抑制劑	羅氏
組織裂解液	Thermo
麗春紅	Beyotime
BCA試劑盒	Beyotime
Western blot 洗液（10×）	Beyotime
30%Acr-Bis	Beyotime
SDS-PAGE電泳液	Beyotime
Western blot轉(zhuǎn)膜液（粉劑）	Beyotime
TEMED	Beyotime
過硫酸銨	Beyotime
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）緩沖液	Beyotime
1 M Tris·HCl（pH=6.8）緩沖液	Beyotime
瓊脂	BD公司
異丙醇	北京化工廠
脫脂奶粉	內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司

3.1.4模型構(gòu)建流程

設計方案

構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據(jù)基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1:

agtcccacgaggaaacag cgg

靶點2:

aggcaaccagagcgctgg cgg

合成的sgRNA單鏈通過退火復性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
顯微注射

超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。
受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。

基因型鑒定

剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
基因組DNA提?。菏褂没蚪MDNA提取試劑盒提取基因組DNA
PCR檢測：根據(jù)序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。

結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
根據(jù)測序結(jié)果確定C9ORF72基HRE敲入模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實驗。

動物模型的評價與驗證

保存方式

冷凍保存、活體繁殖

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