包括實(shí)驗(yàn)材料（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、儀器）、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、細(xì)胞培養(yǎng)/載體構(gòu)建//蛋白表達(dá)/病原培養(yǎng)鑒定方法、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程、動(dòng)物處理倫理等內(nèi)容。
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18003.
3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器
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儀器及耗材
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生產(chǎn)廠商
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NanoZoomer S60數(shù)字病理切片掃描儀
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日本濱松光子學(xué)株式會(huì)社
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Vevo770小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)
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VisualSonics
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激光共聚焦掃描顯微鏡
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Leica
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透射電子顯微鏡
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JEOL
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顯微注射儀
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Nikon
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光學(xué)顯微鏡
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Nikon
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化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)
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BIO-RAD
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PCR儀
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BIO-RAD
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組織脫水機(jī)
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Leica
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石蠟切片機(jī)
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Leica
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石蠟包埋機(jī)
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Leica
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冰凍切片機(jī)
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Leica
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電泳儀
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BIO-RAD
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電泳槽
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Tanon
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數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)
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Tanon
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組織勻漿機(jī)
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POLYTRON
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恒溫培養(yǎng)箱
溫控振蕩箱
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Incucell
TAITEC
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離心機(jī)
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Eppendorf
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搖床
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SCILOGEX
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塑料薄膜封口機(jī)
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德清拜杰有限公司
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電動(dòng)鼓風(fēng)干燥箱
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天津市泰斯特儀器有限公司
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電子稱量器（量程0.5g-620g）
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奧豪斯儀器（常州）有限公司
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電子稱量器（量程0.1mg-220g）
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Sartorius
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4℃冰箱
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海爾集團(tuán)
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-80℃冰箱
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SANYO
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-20℃冰箱
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SANYO
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渦旋振蕩器
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上海滬西分析儀器廠
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移液器
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Eppendorf
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3.1.3實(shí)驗(yàn)試劑
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試劑
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生產(chǎn)廠商
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體外轉(zhuǎn)錄用試劑盒
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Ambion
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Taq DNA聚合酶
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TaKaRa
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T7 轉(zhuǎn)錄試劑盒
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Invitrogen
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T4 DNA裂連接
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TaKaRa
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膠回收試劑盒
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Qiagen
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質(zhì)粒提取試劑盒
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Axygen
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Trizol試劑
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Invitrogen
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逆轉(zhuǎn)錄試劑盒
DNA提取試劑盒
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Invitrogen
北京全式金生物科技有限公司
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Epha4（ab157588）抗體
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Abcam
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GADPH
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Santa Cruz Biotechnology
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NC膜
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Millipore
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化學(xué)發(fā)光液
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Immuno Cruz
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蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物
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Takara
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蛋白酶抑制劑
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羅氏
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組織裂解液
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Thermo
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麗春紅
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Beyotime
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BCA試劑盒
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Beyotime
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Western blot 洗液（10×）
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Beyotime
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30%Acr-Bis
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Beyotime
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SDS-PAGE電泳液
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Beyotime
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Western blot轉(zhuǎn)膜液（粉劑）
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Beyotime
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TEMED
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Beyotime
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過硫酸銨
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Beyotime
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1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）緩沖液
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Beyotime
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1 M Tris·HCl（pH=6.8）緩沖液
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Beyotime
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瓊脂
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BD公司
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異丙醇
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北京化工廠
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脫脂奶粉
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內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司
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3.1.4模型構(gòu)建流程
在Epha4基因的啟動(dòng)子后插入一個(gè)報(bào)告基因mCherry，造成移碼突變，實(shí)現(xiàn)基因敲除，制備Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定，使用Western blot技術(shù)進(jìn)行敲除效率的鑒定。
3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立
3.1.5.1 Epha4敲除大鼠模型的建立
- 設(shè)計(jì)方案
圖 1. Epha4敲除模型構(gòu)建設(shè)計(jì)方案
- 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)并合成sgRNA。
靶點(diǎn)1:
CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG
R-EPHA4-gRNA UP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC
R-EPHA4-gRNA DOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG
靶點(diǎn)2:
CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG
R-EPHA4-gRNA UP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC
R-EPHA4-gRNA DOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG
- 合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
- 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
- 顯微注射
- 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進(jìn)行超排。
- 受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。
- 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。
- 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
- 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。
- 基因型鑒定
- 剪尾編號(hào)：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號(hào)及取材。
- 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
- PCR檢測(cè)：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測(cè)引物并進(jìn)行PCR檢測(cè)。
- 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測(cè)后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號(hào)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測(cè)序。
- 根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立
根據(jù)3.1.5.1獲得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通過8周齡左右Epha4-/-與野生型大鼠進(jìn)行雜交，獲得一定數(shù)量的Epha4+/-大鼠。之后使8周齡左右Epha4+/-大鼠進(jìn)行第二輪雜交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。
- 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
- 12000 rpm 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。
- 加入500 μLBB2，立即渦旋5 s，室溫孵育10 min。
- 將全部的溶液加入離心柱中，8000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm離心1 min，棄掉流出液。
- 重復(fù)步驟（5）一次。
- 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000 rpm 離心1 min，棄掉流出液。
- 重復(fù)步驟（7）一次。
- 10000 rpm 離心2 min，徹底去除殘留的WB2。
- 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5 min，在柱的中央加入50~200 μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3 min，12000 rpm 離心2 min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
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