1. 實(shí)驗(yàn)材料
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司和北京華阜康生物科技股份有限公司。
1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器
Nikon顯微注射儀
Nikon光學(xué)顯微鏡
BIO-RAD電泳儀
Tanon電泳槽
Tanon數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)
Incucell恒溫培養(yǎng)箱溫控
TAITEC振蕩箱
Eppendorf 離心機(jī)
Eppendorf 移液器
2.實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程和動(dòng)物處理倫理
模型制作中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18003，簡(jiǎn)要步驟如下：
2.1 供卵雌鼠超排
實(shí)驗(yàn)第一天8：00 腹腔注射PMSG 30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，實(shí)驗(yàn)第三天10：00 腹腔注射HCG 30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即與與種鼠1：1合籠。實(shí)驗(yàn)第四天8：00～9：00檢查陰道栓，有陰道栓的大鼠在大鼠標(biāo)牌上注明日期和⊕（陽(yáng)性），撿出有陰栓的大鼠進(jìn)行受精卵的收集。
2.2受精卵的收集
2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脫頸處死，解剖大鼠，找到卵巢，輸卵管和子宮，將卵取出，用透明質(zhì)酸酶消除胚泡的黏著，使卵分離。在移換到另外的培養(yǎng)液中，要將透明質(zhì)酸酶充分洗凈（洗約3~5次）。
2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液
2.4. 僅將未損壞的完成操作的卵收集起來，移植到假妊娠大鼠輸卵管中。術(shù)后將大鼠置于安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。
2.5 基因表型鑒定
在判定有導(dǎo)入基因大鼠之后，立即將基因修飾大鼠另行飼養(yǎng)，對(duì)不用的大鼠進(jìn)行處理。陰性大鼠的處理：（1）留和陽(yáng)性大鼠等量的陰性大鼠對(duì)照。（2）剩余的陰性大鼠用于其它符合動(dòng)物倫理的其他實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)（保存記錄）。
3. PON1基因敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與測(cè)序鑒定
利用CRISPR/Cas9 技術(shù)建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶點(diǎn)位于第四外顯子。通過顯微注射成功獲得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小為342bp，能夠穩(wěn)定傳代。PON1 雜合子大鼠之間雜交得到同窩陰性對(duì)照大鼠和敲除純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。大鼠模型資源詳見（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）
圖1 PON1基因敲除設(shè)計(jì)策略
|
掃一掃，更多精彩