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多肽類樣品檢測

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發(fā)布時間：2025-04-14 14:10:59 更新時間：2025-04-13 14:12:58

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

一、結(jié)構(gòu)確證

分子量測定
- 方法：MALDI-TOF質(zhì)譜、ESI質(zhì)譜
- 意義：驗(yàn)證目標(biāo)多肽的分子量是否與理論值一致，判斷是否存在翻譯后修飾或降解。
- 誤差范圍：通常允許±1 Da誤差（高分辨質(zhì)譜可達(dá)±0.01 Da）。
氨基酸序列分析
- Edman降解：N端測序，適用于短肽（<50個氨基酸）。
- 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）：通過肽段碎片離子匹配數(shù)據(jù)庫，解析全長序列。
- 基因測序驗(yàn)證：對于重組多肽，需與表達(dá)載體序列比對。
二硫鍵定位
- 還原/非還原電泳：對比SDS-PAGE遷移率差異。
- 質(zhì)譜法：通過酶解后肽段分子量差異判斷二硫鍵連接位點(diǎn)。

二、純度與雜質(zhì)分析

純度檢測
- HPLC：反相色譜法（C18柱）為主，檢測主峰面積占比（通常要求>95%）。
- 毛細(xì)管電泳（CE）：適用于帶電荷多肽的純度評估。
- SDS-PAGE：檢測高分子量雜質(zhì)（如聚合體）。
雜質(zhì)鑒定
- 工藝相關(guān)雜質(zhì)：宿主細(xì)胞蛋白殘留（ELISA法）、內(nèi)毒素（鱟試劑法）。
- 降解產(chǎn)物：氧化（Met、Trp）、脫酰胺（Asn、Gln）、水解片段分析。
- 手性雜質(zhì)：手性HPLC檢測D-型氨基酸污染。

三、理化性質(zhì)檢測

等電點(diǎn)測定
- 方法：等電聚焦電泳（IEF）或毛細(xì)管等電聚焦（cIEF）。
- 應(yīng)用：指導(dǎo)純化工藝，預(yù)測多肽在不同pH下的溶解性。
疏水性分析
- 反相色譜保留時間：間接反映疏水性強(qiáng)弱。
- 熒光探針法：如ANS結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定表面疏水區(qū)域。
溶解性與穩(wěn)定性
- 溶解度測試：測定臨界聚集濃度（CAC）。
- 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)：高溫（40℃）、光照、不同pH條件下考察降解速率。

四、生物學(xué)活性檢測

體外活性
- 受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)：SPR表面等離子共振技術(shù)測定KD值。
- 酶活性抑制/激活：如ACE抑制肽的IC50測定。
細(xì)胞水平活性
- 報告基因法：檢測信號通路激活效率。
- 增殖/凋亡實(shí)驗(yàn)：MTT法、流式細(xì)胞術(shù)分析。
體內(nèi)活性
- 動物模型驗(yàn)證：如降壓肽的大鼠血壓監(jiān)測。

五、含量定量分析

絕對定量
- 氨基酸分析法：酸水解后HPLC測定各氨基酸摩爾比。
- UV法：利用Trp/Tyr的280 nm吸光值（需校正消光系數(shù)）。
相對定量
- BCA/Bradford法：快速估測溶液濃度。
- 熒光標(biāo)記定量：如FITC標(biāo)記多肽的熒光分光光度法。

六、微生物與安全性檢測

無菌試驗(yàn)：膜過濾法培養(yǎng)14天，符合藥典要求。
內(nèi)毒素檢測：鱟試劑法（限值通常<0.1 EU/mg）。
過敏原篩查：ELISA法檢測常見過敏原交叉污染。

七、穩(wěn)定性研究

強(qiáng)制降解試驗(yàn)：酸/堿/氧化/高溫/光照條件下的降解產(chǎn)物分析。
長期穩(wěn)定性：實(shí)時監(jiān)測儲存條件（如2-8℃、-20℃）下的效價變化。
制劑相容性：考察輔料對多肽穩(wěn)定性的影響。

八、新興檢測技術(shù)

氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）：解析多肽構(gòu)象動態(tài)變化。
圓二色譜（CD）與核磁共振（NMR）：研究二級/三級結(jié)構(gòu)。
單分子成像技術(shù)：AFM、冷凍電鏡觀察多肽聚集狀態(tài)。

結(jié)論

多肽類樣品的檢測需構(gòu)建“結(jié)構(gòu)-功能-質(zhì)量”三位一體的評價體系。隨著質(zhì)譜、微流控芯片等技術(shù)的發(fā)展，檢測正向高通量、高靈敏、微型化方向演進(jìn)。嚴(yán)格的質(zhì)量控制是保證多肽藥物療效與安全性的核心，尤其在基因治療肽、抗菌肽等創(chuàng)新領(lǐng)域，精準(zhǔn)分析技術(shù)將發(fā)揮更關(guān)鍵作用。