總黃酮（Total Flavonoids）是植物源性食品、藥品及保健品中的重要活性成分，其檢測需圍繞 提取效率、顯色反應穩(wěn)定性、干擾消除及定量準確性 等核心環(huán)節(jié)展開，確保符合 《中國藥典》2020年版、GB/T 22244-2008（保健食品中總黃酮的測定）及AOAC 999.08（植物提取物總黃酮測定）等標準。以下是總黃酮檢測的標準化流程與技術要點：
一、核心檢測方法與標準選擇
| 檢測方法 |
原理 |
適用場景 |
標準依據(jù) |
| 硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法 |
黃酮與Al³?絡合顯色（510nm） |
中藥材、食品、保健品的快速檢測 |
GB/T 22244-2008 |
| HPLC法（槲皮素/蘆丁為標品） |
色譜分離后紫外檢測（360nm） |
高精度定量及單體黃酮分析 |
《中國藥典》2020年版通則0512 |
| 紫外分光光度法（直接法） |
黃酮類紫外吸收（270~280nm） |
粗提物初步篩查 |
AOAC 999.08 |
二、硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法操作流程
1. 試劑配制
- 5%亞硝酸鈉（NaNO?）：5g NaNO?溶解于100mL蒸餾水；
- 10%硝酸鋁（Al(NO?)?）：10g Al(NO?)?·9H?O溶解于100mL蒸餾水；
- 4%氫氧化鈉（NaOH）：4g NaOH溶解于100mL蒸餾水；
- 蘆丁標準溶液：精確稱取蘆丁標準品10mg→甲醇溶解定容至100mL（0.1mg/mL）。
2. 樣品前處理
- 固體樣品：粉碎過40目篩→稱取1.0g→加入70%乙醇50mL→超聲提取30min（60℃）→離心（4000rpm×10min）→上清液定容至50mL；
- 液體樣品：直接稀釋或離心去除懸浮物。
3. 顯色反應
- 取1mL樣品液→加5% NaNO? 0.3mL→靜置6min；
- 加10% Al(NO?)? 0.3mL→靜置6min；
- 加4% NaOH 4mL→補蒸餾水至10mL→靜置15min；
- 空白管以蒸餾水替代樣品液，同法操作。
4. 吸光度測定
- 儀器：紫外-可見分光光度計（如島津UV-2600）；
- 波長：510nm，1cm比色皿；
- 計算： 總黃酮含量（mg/g或mg/mL）=(A樣品−A空白)×C標準×V總A標準×m樣品總黃酮含量（mg/g或mg/mL）=A標準?×m樣品?(A樣品?−A空白?)×C標準?×V總?? （C標準C標準?：蘆丁濃度，V總V總?：樣品總體積，m樣品m樣品?：樣品質量）
三、HPLC法操作流程（以槲皮素為例）
1. 色譜條件
- 色譜柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）；
- 流動相：A相（0.1%甲酸水），B相（乙腈）；
- 梯度：0~20min，B相10%→50%；
- 流速：1.0mL/min；
- 檢測波長：360nm；
- 柱溫：30℃。
2. 樣品處理
3. 定量分析
- 以槲皮素為標準品繪制標準曲線（0.1~50μg/mL，R²≥0.999）；
- 外標法計算總黃酮含量（以槲皮素當量計）。
四、檢測設備與試劑
| 檢測方法 |
推薦設備/試劑 |
關鍵參數(shù)/用途 |
| 比色法 |
紫外分光光度計（島津UV-2600） |
波長范圍190~900nm，精度±0.3nm |
| HPLC法 |
高效液相色譜儀（Agilent 1260） |
DAD檢測器，柱溫箱精度±0.1℃ |
| 標準品 |
蘆?。?ge;98%）、槲皮素（≥98%） |
中國藥品生物制品檢定所提供 |
| 提取溶劑 |
70%乙醇、甲醇（色譜純） |
低紫外吸收，避免干擾 |
| 離心機 |
高速離心機（Thermo） |
轉速≥10,000rpm，容量50mL×6 |
五、常見問題與解決方案
| 問題現(xiàn)象 |
可能原因 |
優(yōu)化措施 |
| 顯色不穩(wěn)定（吸光度漂移） |
反應時間控制不當或pH波動 |
嚴格計時（±30s），調節(jié)NaOH濃度至pH 12~13 |
| 回收率低（＜90%） |
提取不徹底或黃酮降解 |
優(yōu)化提取條件（60%乙醇+50℃超聲），避光操作 |
| HPLC基線噪音大 |
流動相未脫氣或色譜柱污染 |
超聲波脫氣流動相，定期沖洗色譜柱（甲醇:水=80:20） |
| 標準曲線線性差（R²＜0.99） |
標品濃度梯度設置不合理 |
加密低濃度點（0.1、0.5、1、5、10μg/mL） |
| 樣品前處理復雜 |
多糖/蛋白質干擾 |
加入Sevag試劑（氯仿:正丁醇=4:1）去蛋白 |
六、應用場景檢測重點
-
中藥材（如銀杏葉、葛根）：
- 關鍵指標：總黃酮含量≥24%（銀杏葉提取物，GB/T 30675-2023）；
- 干擾處理：去除鞣質（聚酰胺吸附法）。
-
保健食品（如蜂膠、葡萄籽）：
- 合規(guī)要求：總黃酮標注值誤差≤±10%（GB 16740-2023）；
- 檢測方法：優(yōu)先選用HPLC法（避免色素干擾）。
-
功能性食品（如茶飲料）：
- 快速篩查：紫外分光光度法初測，比色法復核；
- 穩(wěn)定性：檢測加工過程中黃酮損失率（高溫/光照影響）。
總結
總黃酮檢測需以 “提取完全、顯色穩(wěn)定、數(shù)據(jù)可靠” 為核心原則：
- 方法選擇：比色法用于常規(guī)檢測，HPLC法用于高精度分析；
- 技術創(chuàng)新：在線衍生化技術、超高效液相色譜（UHPLC）；
- 應用價值：保障產(chǎn)品質量、支持功能聲稱、滿足法規(guī)合規(guī)。
實施建議：
- 根據(jù)樣品基質選擇方法（復雜基質優(yōu)先HPLC）；
- 定期驗證方法準確性（加標回收率85%~115%）；
- 通過 CNAS/CMA認證實驗室 出具報告；
- 建立 黃酮成分數(shù)據(jù)庫，優(yōu)化工藝參數(shù)（提取溫度/溶劑比例）。
通過科學檢測與工藝優(yōu)化，可精準量化植物資源中的黃酮價值，為食品、藥品及保健品研發(fā)提供關鍵數(shù)據(jù)支撐。
CMA認證
檢驗檢測機構資質認定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認可
實驗室認可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認證
質量管理體系認證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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