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多糖檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-18 15:13:22 更新時(shí)間：2025-03-17 15:14:06

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

多糖檢測(cè)需圍繞含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)表征、分子量分布及生物活性四大核心展開，適用于食品、藥品、生物制品等領(lǐng)域。遵循國家標(biāo)準(zhǔn)（《中國藥典》2020版）、國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 11292、AOAC 999.03）及行業(yè)規(guī)范，以下是系統(tǒng)化檢測(cè)方案：

一、核心檢測(cè)項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)

1. 多糖含量測(cè)定

總多糖含量：
- 苯酚-硫酸法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法（葡萄糖為對(duì)照，波長490nm，GB/T 15672）；
- DNS法（3,5-二硝基水楊酸）：還原糖測(cè)定，適用于水解后檢測(cè)（AOAC 999.03）。
特異性多糖：
- HPLC-ELSD/RID：柱前衍生（PMP）測(cè)單糖組成（如葡萄糖、甘露糖比例），C18柱（藥典通則0512）；
- 酶聯(lián)免疫法（ELISA）：針對(duì)特定多糖（如β-葡聚糖），靈敏度達(dá)ng級(jí)。

2. 結(jié)構(gòu)表征

單糖組成分析：
- GC-MS：硅烷化衍生（BSTFA）測(cè)中性糖、糖醛酸（ISO 11292）；
- 離子色譜（HPAEC-PAD）：直接測(cè)氨基糖、唾液酸（CarboPac PA20柱）。
糖鏈連接方式：
- 核磁共振（NMR）：¹³C/¹H譜分析糖苷鍵類型（α/β構(gòu)型，藥典通則0441）；
- 紅外光譜（FTIR）：特征峰（如O-H 3400cm?¹，C-O 1070cm?¹）輔助驗(yàn)證。

3. 分子量分布

凝膠滲透色譜（GPC/SEC）：
- 多角度激光光散射（MALLS）：絕對(duì)分子量測(cè)定（適用10³~10? Da，ASTM D6474）；
- 示差折光檢測(cè)（RID）：相對(duì)分子量分布（TSK-GEL色譜柱）。

4. 生物活性檢測(cè)

免疫調(diào)節(jié)活性：
- 巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)（中性紅法，檢測(cè)NO/TNF-α分泌）；
- 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT法，刺激指數(shù)≥1.5為有效）。
抗氧化活性：
- DPPH/ABTS自由基清除率（IC50≤5mg/mL為高活性）；
- FRAP法（鐵還原能力，與抗壞血酸對(duì)照）。

二、檢測(cè)方法與設(shè)備

含量與結(jié)構(gòu)分析設(shè)備：
- 紫外分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000，苯酚-硫酸法）；
- HPLC-ELSD（Agilent 1260，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，C18色譜柱）。
分子量測(cè)定設(shè)備：
- GPC-MALLS（Wyatt DAWN HELEOS，ASTM D6474）；
- 超高效聚合物色譜（APC）（Waters ACQUITY APC，快速分析10?~10? Da）。
生物活性檢測(cè)平臺(tái)：
- 酶標(biāo)儀（BioTek Synergy H1，MTT/DPPH檢測(cè)）；
- 流式細(xì)胞儀（BD FACS Canto II，免疫細(xì)胞活性分析）。

三、質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)

樣品前處理：
- 脫蛋白：Sevage法（氯仿:正丁醇=4:1）或酶解法（胰蛋白酶+胃蛋白酶）；
- 脫色素：活性炭吸附或大孔樹脂純化（AB-8樹脂，乙醇梯度洗脫）。
方法驗(yàn)證：
- 線性范圍：標(biāo)準(zhǔn)曲線R²≥0.995；
- 加標(biāo)回收率：80-120%（苯酚-硫酸法，葡萄糖加標(biāo)）。
數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性控制：
- 內(nèi)標(biāo)法：甘露醇/木糖醇作為內(nèi)標(biāo)（GC-MS分析）；
- 平行實(shí)驗(yàn)：至少3次重復(fù)，RSD≤5%。

四、常見問題與解決方案

問題	原因分析	解決方案
苯酚-硫酸法顯色異常	硫酸濃度不均或顯色時(shí)間過長	控制反應(yīng)溫度（25℃±2℃），嚴(yán)格計(jì)時(shí)5min
HPLC峰重疊	單糖衍生不完全或色譜柱效下降	優(yōu)化衍生條件（70℃×30min），更換色譜柱
分子量分布偏差	柱效降低或流動(dòng)相離子強(qiáng)度波動(dòng)	定期校準(zhǔn)色譜柱，控制緩沖液pH（6.8±0.1）
生物活性不穩(wěn)定	多糖提取物含雜質(zhì)或降解	增加純化步驟（超濾/透析），低溫保存樣品

五、標(biāo)準(zhǔn)與認(rèn)證參考

國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：
- 《中國藥典》2020版（多糖含量測(cè)定，通則0512）；
- GB/T 35818-2018《保健食品中粗多糖的測(cè)定》。
國際標(biāo)準(zhǔn)：
- AOAC 999.03（膳食纖維中多糖測(cè)定）；
- ISO 11292-2021（速溶咖啡中多糖檢測(cè)）。

六、應(yīng)用場(chǎng)景與建議

食品行業(yè)：
- 功能性評(píng)價(jià)：如香菇多糖增強(qiáng)免疫力（需ELISA+細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）；
- 質(zhì)控指標(biāo)：飲料中可溶性多糖≥1.0%（苯酚-硫酸法）。
藥品研發(fā)：
- 結(jié)構(gòu)確證：注射用多糖分子量均一性（GPC-MALLS）；
- 穩(wěn)定性研究：加速試驗(yàn)（40℃/75%RH×6個(gè)月）監(jiān)測(cè)降解。

總結(jié) 多糖檢測(cè)需以“精準(zhǔn)定量、結(jié)構(gòu)明確、活性可靠”為目標(biāo)，結(jié)合經(jīng)典方法（苯酚-硫酸法）與高端技術(shù)（NMR、GPC-MALLS），并根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景選擇檢測(cè)策略。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立從原料提?。摰鞍?脫色）到成品分析（分子量/活性）的全流程質(zhì)控體系，并通過藥典/ISO方法驗(yàn)證確保合規(guī)性。針對(duì)高附加值產(chǎn)品（如藥用多糖），建議聯(lián)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)+動(dòng)物模型驗(yàn)證功能活性，提升產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力。