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動(dòng)物轉(zhuǎn)移因子活性檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-12 15:43:52 更新時(shí)間：2025-03-11 15:47:13

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

動(dòng)物轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor, TF）是從動(dòng)物免疫細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）中提取的小分子多肽，具有傳遞免疫信息的功能。其活性檢測(cè)需圍繞 免疫調(diào)節(jié)能力、特異性反應(yīng)及生物學(xué)效價(jià) 展開，適用于獸藥研發(fā)、免疫增強(qiáng)劑評(píng)價(jià)及生物制品質(zhì)量控制。以下是基于 《中國(guó)獸藥典》2020版、FDA-CVM Guideline 1240.3600（免疫調(diào)節(jié)劑評(píng)估） 及 ISO 17025:2017（檢測(cè)方法驗(yàn)證） 的系統(tǒng)化檢測(cè)方案：

一、活性檢測(cè)核心方法

檢測(cè)方法	原理	適用場(chǎng)景	標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)
淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)	TF刺激淋巴細(xì)胞增殖（MTT法檢測(cè)代謝活性）	體外免疫活性定量	USP <1032>
遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）	致敏動(dòng)物皮內(nèi)注射TF，測(cè)量紅腫直徑變化	體內(nèi)免疫應(yīng)答評(píng)估	OECD 442
細(xì)胞因子釋放檢測(cè)	ELISA法測(cè)定IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子濃度	免疫調(diào)節(jié)通路分析	ISO 17025:2017
動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)	接種病原后TF處理組與對(duì)照組的存活率對(duì)比	抗感染效力驗(yàn)證	FDA-CVM 1240.3600

二、標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程（以淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)為例）

1. 樣品制備

TF提取：
1. 取動(dòng)物脾臟淋巴細(xì)胞，凍融裂解后超濾（截留分子量3.5~10 kDa）；
2. 透析脫鹽，凍干保存（活性損失≤5%）。
陽性對(duì)照：刀豆蛋白A（ConA，5μg/mL）；陰性對(duì)照：RPMI-1640培養(yǎng)基。

2. 實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞培養(yǎng)：
- 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液（1×10? cells/mL）接種于96孔板，每孔100μL；
- 加入TF樣品（梯度濃度：0.1~100μg/mL）或?qū)φ眨?7℃、5% CO?培養(yǎng)72h。
MTT檢測(cè)：
- 每孔加MTT溶液（5mg/mL，10μL），繼續(xù)孵育4h；
- 加入DMSO 100μL溶解甲臜結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)570nm吸光度（OD值）。
活性計(jì)算：
- 增殖率 =（OD樣品 - OD陰性） /（OD陽性 - OD陰性）×100%；
- ED50（半數(shù)有效濃度）：通過劑量-效應(yīng)曲線擬合計(jì)算。

3. 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

重復(fù)性：同一批次3次實(shí)驗(yàn)RSD≤15%；
線性范圍：0.5~50μg/mL（R²≥0.98）；
特異性：無內(nèi)毒素（LAL法檢測(cè)≤0.1 EU/mL）。

三、關(guān)鍵試劑與設(shè)備

設(shè)備/試劑	用途	推薦型號(hào)/品牌
酶標(biāo)儀	MTT法吸光度測(cè)定	BioTek Synergy H1（多波長(zhǎng)檢測(cè)）
CO?培養(yǎng)箱	淋巴細(xì)胞培養(yǎng)	Thermo Scientific Heracell 150i
超濾離心管	TF分子量截留純化	Millipore Amicon Ultra-15（10kDa）
ELISA試劑盒	細(xì)胞因子定量（IL-2、IFN-γ）	R&D Systems Quantikine®

四、國(guó)際與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)限值對(duì)比

參數(shù)	中國(guó)獸藥典（2020版）	FDA-CVM 1240.3600
ED50要求 ≤20μg/mL（免疫增強(qiáng)劑）	≤50μg/mL（生物制品）	需提供方法驗(yàn)證報(bào)告
DTH陽性反應(yīng) 紅腫直徑≥5mm（48h）	顯著差異（p<0.05）	動(dòng)物倫理審查合格
細(xì)胞因子釋放 IL-2≥100pg/mL（有效劑量）	劑量依賴性（R²≥0.95）	標(biāo)準(zhǔn)曲線線性符合要求

五、檢測(cè)報(bào)告與質(zhì)量控制

報(bào)告內(nèi)容：
- TF來源（牛、豬、禽類）、批號(hào)、制備工藝；
- 檢測(cè)數(shù)據(jù)（ED50、增殖率、細(xì)胞因子濃度、DTH結(jié)果）；
- 結(jié)論（如“符合《中國(guó)獸藥典》免疫增強(qiáng)劑活性要求”）。
質(zhì)控要點(diǎn)：
- 每批次檢測(cè)內(nèi)毒素（LAL法）和微生物污染（需無菌）；
- 活性穩(wěn)定性測(cè)試（4℃保存30天活性≥90%）。

六、常見問題與解決方案

問題	可能原因	解決方案
增殖率低	TF活性降解或濃度不足	優(yōu)化提取工藝（避免反復(fù)凍融）
背景值高	內(nèi)毒素污染或細(xì)胞死亡	使用去內(nèi)毒素試劑，縮短培養(yǎng)時(shí)間
數(shù)據(jù)波動(dòng)大	細(xì)胞密度不均或操作誤差	標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)≥3次

通過系統(tǒng)化檢測(cè)，可科學(xué)評(píng)估動(dòng)物轉(zhuǎn)移因子的免疫調(diào)節(jié)活性，確保其在疫苗佐劑、抗感染治療中的有效性與安全性。建議結(jié)合 多指標(biāo)聯(lián)檢（增殖+細(xì)胞因子+動(dòng)物模型），并定期進(jìn)行 方法學(xué)驗(yàn)證（精密度、準(zhǔn)確度、線性），以滿足監(jiān)管與產(chǎn)業(yè)化需求。