茶黃素是紅茶中關(guān)鍵的風(fēng)味與色澤成分，由茶多酚（兒茶素類）氧化聚合形成。其檢測對茶葉品質(zhì)評價、工藝優(yōu)化及功能性研究至關(guān)重要。以下是基于 HPLC法（高效液相色譜）、分光光度法 及 國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO 14502-1:2005） 的系統(tǒng)化檢測方案：
一、檢測方法分類與選擇
| 方法 |
原理 |
靈敏度 |
適用場景 |
| HPLC-UV/DAD |
色譜分離后紫外檢測（280nm） |
0.1~10 μg/mL |
精準(zhǔn)定量、多組分分析 |
| UPLC-MS/MS |
超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用 |
0.01~1 μg/mL |
痕量檢測、結(jié)構(gòu)鑒定 |
| 分光光度法 |
Folin-Ciocalteu顯色反應(yīng)（總酚計算間接法） |
1~50 μg/mL |
快速篩查、成本低 |
二、HPLC法檢測流程（ISO 14502-1:2005）
1. 樣品前處理
- 提取溶劑：70%甲醇（含0.1%甲酸），料液比1:50（m/v）；
- 提取條件：70℃水浴振蕩30分鐘，離心（8000rpm，10min），過0.45μm濾膜。
2. 色譜條件
| 參數(shù) |
設(shè)定值 |
| 色譜柱 |
C18柱（250mm×4.6mm，5μm，如Agilent ZORBAX） |
| 流動相 |
A：0.1%甲酸水；B：乙腈 |
| 梯度程序 |
010min：10%→25% B；1020min：25%→35% B |
| 流速 |
1.0mL/min |
| 柱溫 |
30℃ |
| 檢測波長 |
280nm（茶黃素特征吸收峰） |
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量
- 標(biāo)準(zhǔn)品：茶黃素（Theaflavin, TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3'-沒食子酸酯（TF-3'-G）、茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（TFDG）；
- 配制梯度濃度：0.5、1、5、10、20μg/mL；
- 定量公式： 茶黃素含量（mg/g）=C×VW×1000茶黃素含量（mg/g）=WC×V?×1000
- CC：HPLC測得濃度（μg/mL）；
- VV：提取液體積（mL）；
- WW：樣品質(zhì)量（g）。
4. 方法驗證
- 線性范圍：0.5~50μg/mL（R²≥0.999）；
- 檢測限（LOD）：0.05μg/mL（S/N=3）；
- 定量限（LOQ）：0.1μg/mL（S/N=10）；
- 加標(biāo)回收率：95%~105%；
- 精密度：RSD≤3%（日內(nèi)）、≤5%（日間）。
三、分光光度法（總茶黃素快速篩查）
1. 顯色反應(yīng)
- 試劑：Folin-Ciocalteu試劑、20% Na?CO?；
- 步驟：
- 樣品提取液（同HPLC法）稀釋至適當(dāng)濃度；
- 加入Folin-Ciocalteu試劑（0.5mL）混勻，靜置5min；
- 加入Na?CO?（1.5mL），定容至10mL，避光反應(yīng)30min；
- 765nm處測吸光度，以沒食子酸當(dāng)量（GAE）計算總酚含量，間接推算茶黃素比例。
2. 換算系數(shù)
- 經(jīng)驗公式：茶黃素含量 ≈ 總酚 × 0.15（紅茶中茶黃素占總酚約10%~20%）；
- 注意：需結(jié)合HPLC校準(zhǔn)，避免其他多酚干擾。
四、國際與國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對比
| 參數(shù) |
ISO 14502-1:2005 |
GB/T 8313-2018（中國） |
AOAC 2005.02（美國） |
| 檢測對象 紅茶中茶黃素及兒茶素 |
茶多酚總量 |
紅茶中茶黃素特異檢測 |
|
| 方法 HPLC-UV/DAD |
分光光度法 |
HPLC-MS/MS |
|
| 定量范圍 0.1~50μg/mL |
10~500μg/mL（總酚） |
0.01~10μg/mL |
|
五、關(guān)鍵儀器與試劑
| 設(shè)備/試劑 |
用途 |
推薦型號/品牌 |
| 高效液相色譜儀 |
茶黃素分離與定量 |
Agilent 1260 Infinity II（DAD檢測器） |
| 質(zhì)譜聯(lián)用儀 |
痕量檢測與結(jié)構(gòu)確認(rèn) |
Waters Xevo TQ-S micro |
| 紫外分光光度計 |
總酚快速篩查 |
Shimadzu UV-2600i |
| 茶黃素標(biāo)準(zhǔn)品 |
定量校準(zhǔn) |
Sigma-Aldrich（純度≥98%） |
六、注意事項
- 樣品保存：茶葉粉碎后密封避光（-20℃），防止氧化；
- 提取避光：茶黃素對光敏感，全程棕色玻璃器皿操作；
- 色譜柱維護：每100次進樣后反向沖洗色譜柱（100%乙腈，30min）；
- 基質(zhì)干擾：深發(fā)酵茶（如普洱熟茶）需SPE凈化（C18柱，甲醇洗脫）。
通過上述方法，可精準(zhǔn)評估紅茶中茶黃素含量，指導(dǎo)生產(chǎn)工藝優(yōu)化與產(chǎn)品分級。建議優(yōu)先采用HPLC法確保數(shù)據(jù)可靠性，分光光度法作為輔助快速篩查工具。
CMA認(rèn)證
檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實驗室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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