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菌落總數(shù)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-12 11:18:36 更新時(shí)間：2025-03-11 11:20:26

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

菌落總數(shù)（Total Viable Count, TVC）是評(píng)價(jià)樣品（食品、水、化妝品、環(huán)境等）中需氧或兼性厭氧微生物污染程度的核心指標(biāo)，反映衛(wèi)生狀況及潛在腐敗風(fēng)險(xiǎn)。以下是基于 GB 4789.2-2022（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)）、ISO 4833-1:2013 及 USP <61> 的通用檢測(cè)流程：

一、檢測(cè)原理與適用范圍

原理：通過傾注平板法或涂布法，在特定培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，統(tǒng)計(jì)單位質(zhì)量/體積樣品中形成的菌落數(shù)（CFU/g或CFU/mL）。
適用樣品：食品、飲用水、藥品原料、化妝品、環(huán)境拭子等。

二、設(shè)備與材料

類別	設(shè)備/試劑	規(guī)格/要求
培養(yǎng)基	平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）	滅菌后pH 7.0±0.2，46℃保溫備用
稀釋液	磷酸鹽緩沖液（PBS, 0.85% NaCl）	滅菌后pH 7.2~7.4
耗材	無菌培養(yǎng)皿、移液管、均質(zhì)袋	預(yù)滅菌（121℃, 15min）
儀器	恒溫培養(yǎng)箱、均質(zhì)器、菌落計(jì)數(shù)器	培養(yǎng)溫度30~37℃（依標(biāo)準(zhǔn)選擇）

三、操作流程

1. 樣品制備與稀釋

固體樣品：無菌稱取25g，加入225mL PBS，均質(zhì)2min（拍擊式均質(zhì)器，頻率≥8次/秒），得10?¹稀釋液。
液體樣品：直接吸取25mL+225mL PBS，混勻得10?¹稀釋液。
梯度稀釋：依次取1mL前稀釋液+9mL PBS，制成10?²、10?³等梯度（通常選擇2~3個(gè)梯度）。

2. 傾注平板

取1mL各稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿；
倒入15~20mL冷卻至46℃的PCA，迅速旋轉(zhuǎn)混勻；
凝固后倒置培養(yǎng)。

3. 培養(yǎng)條件

食品/化妝品：30~37℃培養(yǎng)48±2小時(shí)（GB 4789.2）；
飲用水：35℃培養(yǎng)24小時(shí)（EPA 9215D）；
藥品：30~~35℃培養(yǎng)3~~5天（USP <61>）。

4. 菌落計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)規(guī)則：選擇菌落數(shù)30~300 CFU/皿的稀釋度；

四、結(jié)果判定與報(bào)告

樣品類型	安全限值（示例）	標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)
即食食品 ≤10? CFU/g	GB 29921-2021
飲用水 ≤100 CFU/mL（總大腸菌群未檢出）	GB 5749-2022
化妝品膏霜 ≤500 CFU/g（眼/唇部≤100）	《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2022

報(bào)告要求：

注明檢測(cè)方法（如GB 4789.2-2022）；
菌落總數(shù)結(jié)果（保留兩位有效數(shù)字，如1.3×10? CFU/g）；
若所有稀釋度均<1 CFU，報(bào)告“<1×最低稀釋倍數(shù)”（如<10 CFU/g）。

五、質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)

空白對(duì)照：稀釋液+培養(yǎng)基不接種樣品，應(yīng)無菌落生長；
平行試驗(yàn)：每個(gè)稀釋度至少2個(gè)平行皿，允許誤差≤15%（同稀釋度菌落數(shù)差異）；
干擾處理：
- 顆粒干擾：樣品含不溶物時(shí)，用含0.1%吐溫80的PBS稀釋；
- 抑菌性：若樣品抑制微生物生長（如含防腐劑），需中和處理（如添加卵磷脂、硫代硫酸鈉）；
菌落識(shí)別：
- 排除氣泡、雜質(zhì)及蔓延菌落（H?O重新凝固后計(jì)數(shù)非蔓延區(qū)）。

六、常見問題與解決方案

問題	原因分析	優(yōu)化措施
菌落過多無法計(jì)數(shù)	稀釋梯度不足或樣品污染	增加稀釋梯度（如10??、10??），縮短取樣與操作時(shí)間
菌落蔓延（衛(wèi)星狀）	培養(yǎng)基過濕或冷凝水過多	減少倒板量（15mL/皿），預(yù)干燥培養(yǎng)基表面
無菌落生長	樣品抑菌或操作污染	增加中和劑，驗(yàn)證無菌操作（酒精燈旁操作）
結(jié)果重復(fù)性差	稀釋不均或培養(yǎng)溫度波動(dòng)	均質(zhì)時(shí)間延長至3min，校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度（±0.5℃）

七、快速檢測(cè)方法（補(bǔ)充）

顯色培養(yǎng)基法：如3M Petrifilm™菌落總數(shù)測(cè)試片（37℃培養(yǎng)24h，紅色菌落計(jì)數(shù)）；
ATP生物發(fā)光法：5分鐘內(nèi)檢測(cè)總微生物量（需校準(zhǔn)與菌落計(jì)數(shù)的相關(guān)性）；
流式細(xì)胞術(shù)：針對(duì)水樣快速定量活菌（ISO 19344:2015）。

通過標(biāo)準(zhǔn)化的菌落總數(shù)檢測(cè)，可有效評(píng)估樣品的微生物安全水平。建議定期參與能力驗(yàn)證（如CNAS PT計(jì)劃），并建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部SOP（標(biāo)準(zhǔn)操作程序），確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可比性。