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英光定量檢測

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發(fā)布時間：2025-03-07 09:45:13 更新時間：2025-03-06 09:46:52

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

一、檢測原理與分類

熒光定量檢測通過 熒光信號強度 與 目標(biāo)物濃度 的關(guān)聯(lián)實現(xiàn)精確定量，廣泛應(yīng)用于 基因表達分析（qPCR）、蛋白互作（FRET）、病原體檢測 及 單細(xì)胞測序 等領(lǐng)域。核心方法包括：

實時熒光定量PCR（qPCR）：
- 探針法（TaqMan）：探針?biāo)忉尫艧晒庑盘枺禺愋愿撸?/li>
- 染料法（SYBR Green）：非特異性結(jié)合雙鏈DNA，成本低但需熔解曲線驗證。
酶聯(lián)免疫熒光分析（ELISA-FL）：結(jié)合酶標(biāo)抗體與熒光底物，靈敏度達fg級。
數(shù)字PCR（dPCR）：微滴分區(qū)實現(xiàn)絕對定量，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、核心實驗流程與優(yōu)化要點

1. qPCR實驗流程

步驟	操作要點
引物/探針設(shè)計	- 引物Tm值58-62℃，長度18-25bp，避免二聚體（工具：Primer-BLAST、OligoAnalyzer） - TaqMan探針5'端標(biāo)記FAM，3'端淬滅基團（如BHQ1）
模板制備	- RNA提?。≧IN≥8，A260/A280=1.8-2.0） - cDNA合成（使用高保真反轉(zhuǎn)錄酶，避免基因組污染）
反應(yīng)體系優(yōu)化	- 模板量：10-100ng cDNA/反應(yīng) - 引物濃度：100-400nM（探針50-200nM） - 鎂離子：1.5-3.0mM（梯度優(yōu)化）
擴增程序	- 預(yù)變性：95℃×3min - 循環(huán)：95℃×15s → 60℃×60s（40-45 cycles） - 熔解曲線：60℃→95℃（0.5℃/s）
數(shù)據(jù)分析	- Ct值≤35（有效擴增） - 擴增效率（E）計算：E = 10^(-1/slope) -1（理想值90-110%） - 相對定量：ΔΔCt法（內(nèi)參基因驗證穩(wěn)定）

2. 熒光ELISA實驗流程

步驟	操作要點
包被與封閉	- 抗原包被濃度1-10μg/mL（4℃過夜） - 封閉液：5% BSA或脫脂奶粉（室溫1h）
抗體孵育	- 一抗?jié)舛忍荻葍?yōu)化（1:1000-1:5000） - 熒光二抗（如Cy5標(biāo)記）避光孵育（室溫1h）
信號檢測	- 激發(fā)/發(fā)射波長匹配（如Cy5：650/670nm） - 酶標(biāo)儀讀取熒光值（RFU）

三、關(guān)鍵問題與解決方案

常見問題	可能原因	解決方案
qPCR擴增效率低	引物二聚體或模板降解	重新設(shè)計引物，驗證RNA完整性（Agilent 2100 Bioanalyzer）
熔解曲線多峰	非特異性擴增或引物濃度過高	降低引物濃度，優(yōu)化退火溫度（梯度PCR），或改用探針法
熒光信號弱（ELISA）	抗體效價低或熒光淬滅	提高一抗?jié)舛?，更換新鮮熒光二抗，避光操作
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差	模板稀釋誤差或抑制劑殘留	使用無核酸酶水稀釋模板，添加BSA（0.1μg/μL）或優(yōu)化提取方法
重復(fù)性差	加樣誤差或溫度不均	使用自動分液系統(tǒng)（如Eppendorf epMotion），驗證熱循環(huán)儀孔間溫差（≤0.5℃）

四、儀器與試劑選擇

1. 核心設(shè)備推薦

設(shè)備類型	功能與要求	推薦型號
實時熒光定量PCR儀	多通道檢測（FAM/HEX/ROX/Cy5）	Applied Biosystems QuantStudio 5
熒光酶標(biāo)儀	支持終點/動力學(xué)檢測，靈敏度≤1fM	Tecan Spark 20M
數(shù)字PCR系統(tǒng)	絕對定量，分區(qū)數(shù)≥20,000	Bio-Rad QX200

2. 試劑選擇要點

qPCR預(yù)混液：含UNG酶防污染（如TaKaRa Ex Taq® Probe qPCR）
反轉(zhuǎn)錄酶：高擴增效率且耐抑制物（如Thermo SuperScript IV）
熒光探針：淬滅效率≥95%（BHQ系列優(yōu)于TAMRA）

五、數(shù)據(jù)分析與驗證

1. qPCR數(shù)據(jù)驗證

內(nèi)參基因穩(wěn)定性：geNorm或NormFinder評估（CV≤0.5）；
擴增效率計算：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（-3.1至-3.6）；
差異表達閾值：|ΔΔCt|≥1（表達量差異≥2倍）。

2. 熒光ELISA數(shù)據(jù)處理

背景扣除：空白孔熒光值均值作為基準(zhǔn)；
標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合：4PL或?qū)?shù)線性回歸（R²≥0.99）；
靈敏度（LOD）：3倍背景信號對應(yīng)的濃度。

六、前沿技術(shù)拓展

多重檢測：
- 多色探針（FAM/HEX/Cy5）同步檢測多個靶標(biāo)；
- 微流控芯片實現(xiàn)單細(xì)胞qPCR（Fluidigm C1）。
活體成像：
- 近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光探針（波長1000-1700nm）提升穿透深度；
- 轉(zhuǎn)基因熒光報告基因（如tdTomato）追蹤細(xì)胞動態(tài)。
AI輔助分析：
- 深度學(xué)習(xí)自動識別熔解曲線異常（如非特異峰）；
- 大數(shù)據(jù)預(yù)測最佳引物組合（Google DeepPrimer）。

通過系統(tǒng)化熒光定量檢測，可實現(xiàn) 高靈敏度（低至單拷貝）、高特異性（探針法）及 自動化分析，建議實驗者優(yōu)先驗證 引物/抗體性能 并建立 標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP），結(jié)合 技術(shù)創(chuàng)新 提升檢測效率與可靠性。