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高效液相色譜（HPLC）檢測

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發(fā)布時間：2025-03-06 09:13:37 更新時間：2025-03-05 09:20:18

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

一、檢測核心意義與適用領(lǐng)域

高效液相色譜（HPLC）是一種基于 液相分離原理 的分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于 藥物分析（如含量測定、雜質(zhì)分析）、 食品安全（農(nóng)殘、添加劑檢測）、 環(huán)境監(jiān)測（污染物分析）及 生命科學(xué)（蛋白質(zhì)、代謝物研究）。其核心價值在于高分離度、高靈敏度和重復(fù)性，可滿足 痕量分析（ppm級）和 復(fù)雜基質(zhì)分離 需求。

二、核心檢測參數(shù)與儀器配置

1. 儀器基本組件與參數(shù)

組件	關(guān)鍵參數(shù)	推薦配置
泵系統(tǒng)	流量精度（±0.1%），壓力范圍（0~40MPa）	Agilent 1260 Infinity II Quaternary Pump
色譜柱	填料類型（C18、HILIC等），粒徑（3μm/5μm）	Waters XBridge C18（4.6×150mm, 5μm）
檢測器	類型（DAD、熒光、ELSD）、波長范圍（190~900nm）	Agilent DAD G7115A
自動進樣器	進樣精度（RSD≤0.5%），樣品容量（≥100位）	Shimadzu SIL-40AC

2. 方法開發(fā)關(guān)鍵參數(shù)

參數(shù)	優(yōu)化目標	典型范圍
流動相組成	水相（含緩沖鹽）與有機相比例（如甲醇/乙腈）	梯度洗脫：5%~~95%有機相（0~~30min）
流速	平衡分離效率與柱壓	1.0mL/min（常規(guī)分析柱）
柱溫	控制保留時間與峰形	25~40℃（溫控精度±0.5℃）
檢測波長	根據(jù)目標物最大吸收波長設(shè)定	紫外檢測：210nm/254nm/280nm

三、檢測流程與操作規(guī)范

1. 樣品前處理

提取方法：液液萃取（LLE）、固相萃?。⊿PE）、蛋白沉淀（生物樣品）。
過濾要求：過0.22μm濾膜（尼龍/PTFE材質(zhì)），避免堵塞色譜柱。
保存條件：4℃避光保存，防止降解（如維生素、抗生素類樣品）。

2. 系統(tǒng)適用性測試（SST）

指標	要求	測試方法
理論塔板數(shù)（N）	≥2000（主峰）	計算式：N=16(tR/W)2N=16(tR?/W)2
分離度（Rs）	≥1.5（相鄰色譜峰）	計算式：Rs=2(tR2−tR1)/(W1+W2)Rs?=2(tR2?−tR1?)/(W1?+W2?)
拖尾因子（T）	0.9~1.2（對稱峰形）	計算式：T=W0.05/2AT=W0.05?/2A
重復(fù)性（RSD）	保留時間RSD≤1%，峰面積RSD≤2%	連續(xù)進樣6針樣品計算

3. 數(shù)據(jù)采集與分析

積分參數(shù)：閾值（Threshold）、峰寬（Peak Width）、斜率（Slope）。
定量方法：外標法（標準曲線）、內(nèi)標法（校正因子）、面積歸一化法。
報告輸出：保留時間、峰面積/峰高、純度（峰純度分析）。

四、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	解決方案
基線漂移/噪聲	流動相不均勻、檢測池污染	脫氣流動相（超聲/在線脫氣機）、清洗檢測池
峰分叉/拖尾	色譜柱柱效下降、樣品過載	更換色譜柱、稀釋樣品或減少進樣體積
保留時間不穩(wěn)定	柱溫波動、流動相比例偏差	檢查柱溫箱穩(wěn)定性、校準泵的混合精度
壓力異常升高	色譜柱堵塞、濾頭污染	反沖色譜柱、更換保護柱/在線過濾器
靈敏度不足	檢測波長錯誤、光路污染	驗證最佳吸收波長、清洗檢測器流通池

五、標準方法與合規(guī)性

藥典標準：
- 《中國藥典》（ChP）通則0512：HPLC法要求。
- 《美國藥典》（USP）<621>：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性標準。
國際標準：
- ISO 13885-1（分子量分布測定）、AOAC 2007.01（食品中三聚氰胺檢測）。
法規(guī)要求：
- 數(shù)據(jù)完整性符合21 CFR Part 11（電子記錄與簽名）。

六、儀器維護與耗材管理

色譜柱維護：
- 使用后沖洗（高比例有機相保存，如甲醇/乙腈）。
- 定期清洗（0.1% TFA水溶液沖洗30分鐘）。
泵系統(tǒng)維護：
- 更換密封墊（每3~6個月或壓力波動時）。
- 避免緩沖鹽析出（使用后切換至高水相沖洗）。
檢測器維護：
- DAD檢測器：每年校準波長準確性（氘燈/汞燈特征峰）。
- 熒光檢測器：定期更換光源燈（壽命約2000小時）。

七、應(yīng)用案例解析

案例1：藥物雜質(zhì)分析

目標物：阿司匹林原料藥中的水楊酸雜質(zhì)。
方法：
- 色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6×250mm, 5μm）。
- 流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（50:50），流速1.0mL/min。
- 檢測波長：237nm，主峰與雜質(zhì)分離度≥2.0。
結(jié)果：水楊酸含量≤0.1%，符合ChP標準。

案例2：食品中防腐劑檢測

目標物：苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸。
前處理：
- 樣品經(jīng)甲醇提取，C18 SPE柱凈化。
方法：
- 梯度洗脫（乙腈-0.02M乙酸銨），DAD全波長掃描（230nm定量）。
檢出限：0.5mg/kg，滿足GB 2760-2014要求。

八、技術(shù)前沿與創(chuàng)新方向

超高效液相色譜（UHPLC）：
- 亞2μm填料，柱效提升3倍，分析時間縮短70%。
二維液相色譜（2D-LC）：
- 復(fù)雜樣品全組分分離（如中藥指紋圖譜）。
聯(lián)用技術(shù)：
- HPLC-MS（質(zhì)譜聯(lián)用）：高靈敏度定性定量（如代謝組學(xué)）。

通過科學(xué)的方法開發(fā)與系統(tǒng)維護，HPLC可成為 精準分析 的核心工具。建議實驗室建立 標準化SOP（標準操作程序）、定期參與能力驗證（如CNAS認證），并關(guān)注 綠色化學(xué)（減少有機溶劑用量）與 智能化（AI方法優(yōu)化）的發(fā)展趨勢。