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體外遺傳毒性試驗檢測

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發(fā)布時間：2025-08-06 08:08:44 更新時間：2025-08-05 08:08:44

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作者：中科光析科學技術(shù)研究所檢測中心

體外遺傳毒性試驗檢測

體外遺傳毒性試驗檢測是現(xiàn)代毒理學和安全評估體系中的核心環(huán)節(jié)，主要用于評估化學物質(zhì)（包括藥物、化妝品、食品添加劑、工業(yè)化學品、環(huán)境污染物等）在細胞水平上誘導遺傳物質(zhì)（DNA、染色體）發(fā)生損傷或產(chǎn)生突變的能力。這類試驗通常在離體培養(yǎng)的細胞或細菌系統(tǒng)中進行，模擬物質(zhì)在生物體內(nèi)可能引發(fā)的基因突變、染色體畸變或DNA損傷等遺傳學終點。相較于體內(nèi)試驗，體外方法具有操作相對簡便、耗時短、成本低、通量高以及符合動物倫理3R原則（替代、減少、優(yōu)化）的優(yōu)勢，常作為遺傳毒性篩選的首選方法和風險評估的第一道防線，廣泛應用于新產(chǎn)品研發(fā)、注冊申報、環(huán)境監(jiān)控和職業(yè)健康安全等領域。

檢測項目

體外遺傳毒性試驗涵蓋多種終點，核心項目包括：

基因突變試驗： 最經(jīng)典的是細菌回復突變試驗（Ames試驗），利用組氨酸缺陷型沙門氏菌或色氨酸缺陷型大腸桿菌，檢測受試物能否誘發(fā)導致細菌恢復原養(yǎng)型的基因點突變（堿基置換或移碼突變）。
染色體畸變試驗： 在哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO、人外周血淋巴細胞）中，檢測受試物誘導的染色體結(jié)構(gòu)畸變（如斷裂、缺失、易位、環(huán)狀染色體、雙著絲粒體）或數(shù)目畸變（非整倍體、多倍體）。
微核試驗： 在細胞（如TK6人淋巴母細胞、中國倉鼠肺細胞V79）中，檢測受試物誘導產(chǎn)生的微核。微核是染色體片段或整條染色體在有絲分裂后期未進入主核而形成的小核，反映了染色體斷裂或紡錘體功能損傷。
DNA損傷試驗：
- 彗星試驗（單細胞凝膠電泳試驗）： 檢測單個細胞水平上的DNA鏈斷裂（單鏈/雙鏈）。
- 體外微核試驗（結(jié)合細胞阻滯法，如CBMN法）： 不僅能檢測微核，還能同時評估核質(zhì)橋、核芽等反映DNA損傷的核異常。
- DNA加合物檢測： 利用如³²P后標記法、質(zhì)譜法等檢測化學物質(zhì)與DNA共價結(jié)合的產(chǎn)物。

檢測儀器

體外遺傳毒性試驗的進行依賴于一系列精密儀器，主要包括：

細胞培養(yǎng)設備： CO₂培養(yǎng)箱、生物安全柜/超凈工作臺、倒置顯微鏡（用于觀察細胞形態(tài)和融合度）、離心機、液氮罐/深低溫冰箱（用于細胞凍存）、恒溫水浴鍋。
樣品處理與制備設備： 精密天平、pH計、高速冷凍離心機、振蕩器、超聲波破碎儀（用于細胞裂解）、移液器（單道/多道）。
染毒與暴露系統(tǒng)： 受試物溶解/懸浮設備、細胞培養(yǎng)耗材（培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔板）。
核心檢測儀器：
- 光學顯微鏡（配備熒光模塊）： 用于染色體畸變分析、微核計數(shù)、熒光原位雜交(FISH)等鏡檢項目。
- 自動化顯微鏡/掃描儀與圖像分析系統(tǒng)： 用于高通量、自動化的微核、染色體畸變計數(shù)和彗星圖像分析，提高客觀性和效率。
- 流式細胞儀（Flow Cytometry, FCM）： 用于高通量細胞微核分析（如采用流式細胞微核法）、細胞周期分析（判斷受試物是否引起細胞周期阻滯）、細胞活力/凋亡檢測（評估細胞毒性）。
- 凝膠電泳及成像系統(tǒng)： 用于彗星試驗，包括水平電泳槽、電源、熒光顯微鏡或?qū)Ｓ缅缧浅上穹治鱿到y(tǒng)。
- 酶標儀（Microplate Reader）： 用于細菌回復突變試驗（Ames試驗）中菌落計數(shù)（需傾注含指示劑的頂層瓊脂）或顯色反應（如某些定量Ames方法）、細胞毒性試驗（MTT/XTT/CCK-8等活力檢測）的吸光度/熒光/發(fā)光讀取。
- 菌落自動計數(shù)儀： 用于Ames試驗中平板菌落的自動或半自動計數(shù)。
- 分子檢測設備（用于DNA損傷深入分析）： PCR儀、實時熒光定量PCR儀、高通量測序儀（NGS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS, 用于DNA加合物檢測）。
數(shù)據(jù)分析與報告設備： 計算機及專業(yè)圖像分析軟件、統(tǒng)計分析軟件。

檢測方法

標準的體外遺傳毒性試驗遵循嚴格的標準化操作程序（SOPs），主要步驟包括：

實驗設計： 根據(jù)受試物特性、測試目的和法規(guī)要求選擇適當?shù)臏y試系統(tǒng)（細菌/哺乳動物細胞）和試驗項目（組合測試策略常見）。確定劑量范圍（需包括無毒至高毒劑量，通常設置多個濃度梯度）、重復次數(shù)、陰性對照（溶劑/培養(yǎng)基）、陽性對照（已知遺傳毒物）。
受試物制備： 選擇合適溶劑（如水、DMSO、乙醇等）溶解或懸浮受試物，確保無菌、無熱原，濃度準確。
細胞/菌株準備與培養(yǎng)：
- 細菌（Ames）：復蘇、增殖、制備細菌懸液。
- 哺乳動物細胞：復蘇、傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞懸液濃度。
染毒/暴露： 將受試物在特定條件下（如±S9代謝活化系統(tǒng)）與測試系統(tǒng)共培養(yǎng)處理一定時間（依試驗類型而定，如數(shù)小時至幾天）。S9混合物（含肝微粒體酶）用于模擬體內(nèi)代謝活化過程。
處理與采樣：
- Ames：將處理后的細菌與頂層瓊脂混合傾倒在底層瓊脂平板上。
- 染色體畸變：染毒后，加入紡錘體抑制劑（如秋水仙素）阻斷細胞分裂于中期，收獲細胞，低滲處理，固定，制片。
- 微核：染毒后，進行一定時間恢復培養(yǎng)（允許損傷表達），收獲細胞，制片固定（Giemsa染色）或應用CBMN法（細胞松弛素B阻滯胞質(zhì)分裂）。
- 彗星：染毒后收獲細胞，制備單細胞懸液，包埋于瓊脂糖凝膠中，裂解、解旋、電泳、中和、染色。
終點分析：
- Ames：計數(shù)每皿回復突變菌落數(shù)。
- 染色體畸變：顯微鏡下觀察中期分裂相細胞，計數(shù)染色體結(jié)構(gòu)畸變和數(shù)目畸變。
- 微核：顯微鏡或流式細胞儀下計數(shù)含微核的細胞數(shù)（或雙核細胞中含微核的比例）。
- 彗星：顯微鏡或?qū)Ｓ贸上裣到y(tǒng)下分析彗星尾長、尾矩、Olive尾矩等參數(shù)，定量DNA損傷程度。
數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定： 計算各劑量組的突變頻率、畸變率、微核率或DNA損傷指標。采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法（如卡方檢驗、Fisher精確檢驗、t檢驗、方差分析、Dunnett's檢驗、趨勢檢驗）比較處理組與陰性對照組。根據(jù)預定的陽性判斷標準（如劑量依賴性增加，且有統(tǒng)計學顯著性的陽性反應）評價受試物的遺傳毒性潛力。
報告： 詳細記錄試驗過程、原始數(shù)據(jù)、統(tǒng)計結(jié)果、結(jié)論，并評價試驗的有效性（如陽性對照顯著陽性，陰性對照滿足要求，細胞毒性在可接受范圍內(nèi)）。