熱原/細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)：保障藥品與醫(yī)療器械安全的核心屏障
熱原（Pyrogen），特別是細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin），是存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖（LPS）復(fù)合物，是引發(fā)人體或動(dòng)物體發(fā)熱反應(yīng)（即熱原反應(yīng)）的最主要物質(zhì)之一。當(dāng)含有超量熱原/細(xì)菌內(nèi)毒素的注射劑、血液制品、生物制品、植入性醫(yī)療器械等進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)時(shí)，可刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放內(nèi)源性致熱原，導(dǎo)致患者出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱、血壓下降，嚴(yán)重時(shí)甚至休克、死亡。因此，熱原/細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)是藥品、生物制品、醫(yī)療器械（尤其是侵入性器械）生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)，是保障用藥和用械安全的強(qiáng)制性要求，也是各國(guó)藥典（如中國(guó)藥典ChP、美國(guó)藥典USP、歐洲藥典EP）和藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如FDA、EMA、NMPA）嚴(yán)格規(guī)定的核心檢測(cè)項(xiàng)目之一。
根據(jù)檢測(cè)原理和對(duì)象的不同，熱原檢測(cè)主要分為兩大類：熱原檢查法（家兔法）和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET, Bacterial Endotoxin Test，鱟試劑法）。熱原檢查法是一種體內(nèi)試驗(yàn)，直接檢測(cè)樣品引起哺乳動(dòng)物（通常是家兔）體溫升高的能力，能檢測(cè)多種來源的熱原（包括內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩＜?xì)菌內(nèi)毒素檢查法則是一種靈敏、特異的體外試驗(yàn)，利用鱟（hòu）血變形細(xì)胞裂解物中的酶系統(tǒng)與內(nèi)毒素發(fā)生特異性凝集或顯色反應(yīng)的原理，專一性地檢測(cè)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。目前，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速、成本相對(duì)較低且無需使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等優(yōu)勢(shì)，已成為檢測(cè)注射劑等藥品內(nèi)毒素限量的首選方法，并在可能的情況下逐步替代熱原檢查法。但家兔法對(duì)于某些無法通過BET有效檢測(cè)的物質(zhì)（如部分放射性藥品、混懸劑、膠體溶液等）或產(chǎn)品研發(fā)階段的篩選仍有其不可替代的價(jià)值。
核心檢測(cè)項(xiàng)目
熱原/細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的核心項(xiàng)目圍繞著限值（Limit）的符合性展開：
1. 細(xì)菌內(nèi)毒素限量檢查：這是最常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目。通過定性的凝膠法（Gel-Clot）或定量的光度測(cè)定法（包括濁度法和顯色基質(zhì)法），測(cè)定供試品溶液中的內(nèi)毒素含量是否低于該品種規(guī)定的最大允許限量（通常表示為 EU/mL, EU/mg, EU/Unit 等）。
2. 熱原檢查（家兔法）：通過測(cè)量家兔注射供試品溶液后的體溫升高情況，判斷供試品是否引起熱原反應(yīng)。結(jié)果以單只兔體溫升高值和兔群體溫反應(yīng)總和來判定是否符合規(guī)定。
3. 干擾試驗(yàn)：這是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中至關(guān)重要的預(yù)試驗(yàn)。旨在確認(rèn)供試品溶液本身或其配方成分是否會(huì)抑制或增強(qiáng)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。只有通過干擾試驗(yàn)驗(yàn)證，證明供試品溶液在規(guī)定的稀釋倍數(shù)下不干擾檢測(cè)（即回收率在50%-200%范圍內(nèi)），后續(xù)的正式限量檢查結(jié)果才有效。
4. 方法驗(yàn)證與確認(rèn)：在建立新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法或改變?cè)蟹椒〞r(shí)，需要進(jìn)行完整的方法學(xué)驗(yàn)證，包括專屬性、準(zhǔn)確性（回收率）、精密度、定量限/檢測(cè)限、線性與范圍、耐用性等（根據(jù)定量或定性方法要求不同）。
關(guān)鍵檢測(cè)儀器
檢測(cè)的實(shí)施依賴于專用的精密儀器：
1. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀（光度法）：核心設(shè)備。用于光度測(cè)定法（動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法、終點(diǎn)顯色法），精確控制反應(yīng)溫度（通常是37℃±1℃），并連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)溶液濁度或吸光度的變化，通過內(nèi)置軟件計(jì)算反應(yīng)時(shí)間或終點(diǎn)吸光度，進(jìn)而定量測(cè)定內(nèi)毒素濃度。通常配備恒溫孵育模塊、光電檢測(cè)系統(tǒng)、樣品盤/反應(yīng)管架和數(shù)據(jù)采集分析軟件。
2. 恒溫水浴箱/干式恒溫器：用于凝膠法試驗(yàn)，提供精確穩(wěn)定的溫育環(huán)境（通常為37℃±1℃），確保鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)充分進(jìn)行。
3. 漩渦混合器：用于充分混勻鱟試劑、樣品/溶液和標(biāo)準(zhǔn)品。
4. 微量移液器及無菌無熱原槍頭：進(jìn)行高精度液體移取的關(guān)鍵工具，必須保證無菌且無熱原。量程需覆蓋所需范圍（如10μL, 25μL, 100μL, 1mL）。
5. 旋渦混合器：用于充分混勻樣品或溶液。
6. 熱原檢查專用設(shè)備（家兔法）：包括符合規(guī)定的家兔飼養(yǎng)設(shè)施、精確測(cè)溫設(shè)備（如電子測(cè)溫計(jì)，精度達(dá)0.1℃）、兔固定裝置、注射裝置（注射器、針頭）、以及用于加熱和固定體溫探頭的裝置等。
7. 超凈工作臺(tái)/生物安全柜：提供無菌操作環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)過程中樣品污染。
8. 烘箱/干熱滅菌器：用于玻璃器皿（如試管、安瓿、稀釋容器）的去熱原處理（通常需250℃干烤至少30分鐘或180℃干烤2小時(shí)以上）。
主要檢測(cè)方法
主要遵循藥典規(guī)定的方法：
1. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）：
* 凝膠法（Gel-Clot Technique）： 最經(jīng)典、應(yīng)用廣泛的定性或半定量方法。將鱟試劑溶解后，與等體積供試品溶液或標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液在試管或微量反應(yīng)板孔中混合，于37℃±1℃水浴中孵育規(guī)定時(shí)間（通常60±2分鐘）。取出后小心倒轉(zhuǎn)180度觀察：形成堅(jiān)實(shí)凝膠并保持在管底（孔底）為陽(yáng)性（+），未形成凝膠或凝膠不能保持完整呈流動(dòng)狀為陰性（-）。通過與平行操作的系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的凝固終點(diǎn)濃度比較，判斷供試品是否合格（如用標(biāo)示靈敏度λ的鱟試劑，供試品溶液在最大有效稀釋倍數(shù)下為陰性即合格）。
* 光度測(cè)定法（Photometric Techniques）： 定量方法。
* 濁度法（Turbidimetric）： 檢測(cè)反應(yīng)混合物因形成凝膠導(dǎo)致濁度增加。動(dòng)態(tài)濁度法監(jiān)測(cè)濁度隨時(shí)間的變化率（與內(nèi)毒素濃度對(duì)數(shù)成線性關(guān)系）；終點(diǎn)濁度法在反應(yīng)終點(diǎn)測(cè)量濁度值（與內(nèi)毒素濃度成線性關(guān)系）。
* 顯色基質(zhì)法（Chromogenic）： 利用人工合成的顯色底物（如Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）代替天然凝固蛋白原。內(nèi)毒素激活的凝集酶系統(tǒng)水解顯色底物釋放出黃色對(duì)硝基苯胺（pNA），在405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。動(dòng)態(tài)顯色法監(jiān)測(cè)吸光度變化率；終點(diǎn)顯色法在反應(yīng)終點(diǎn)加入顯色終止液后測(cè)量吸光度。
2. 熱原檢查法（家兔法）： 選取符合規(guī)定的健康家兔，測(cè)定其正常體溫后，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)經(jīng)耳緣靜脈注射規(guī)定劑量的供試品溶液。在注射后定時(shí)（通常1, 2, 3小時(shí)）測(cè)量其體溫。根據(jù)每只兔體溫升高的最大值（ΔT）以及同組兔體溫升高的總和（ΣΔT），按照藥典規(guī)定的判定標(biāo)準(zhǔn)（如ChP：每只兔ΔT≤0.5℃且ΣΔT≤1.3℃）來判斷供試品是否合格。
核心檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)
檢測(cè)活動(dòng)嚴(yán)格遵循以下權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)：
1. 各國(guó)藥典： 這是最根本、最具法律效力的標(biāo)準(zhǔn)。
* 《中華人民共和國(guó)藥典》（ChP） - 通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法， 通則1142 熱原檢查法。
* 《美國(guó)藥典》（USP） - Chapter <85> Bacterial Endotoxins Test, Chapter <151> <
CMA認(rèn)證
檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號(hào)：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可證書
證書編號(hào)：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號(hào)：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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