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細胞增殖檢測

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發(fā)布時間：2025-08-03 02:16:26 更新時間：2025-08-02 02:16:26

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作者：中科光析科學技術研究所檢測中心

細胞增殖檢測：揭示細胞生長活力的關鍵窗口

細胞增殖是生命活動的基本過程，對生物體的發(fā)育、組織修復、免疫應答以及疾病（尤其是癌癥）的發(fā)生發(fā)展至關重要。細胞增殖檢測是生命科學、醫(yī)學研究、藥物開發(fā)（如抗癌藥篩選、毒性評估）和臨床診斷中不可或缺的核心技術手段。它通過定量或半定量地評估細胞在給定時間內(nèi)分裂和生長的能力，為研究細胞周期調(diào)控、信號通路功能、藥物效應（如抑制或促進增殖）、環(huán)境因子影響等提供了直接的實驗依據(jù)。精確可靠的細胞增殖數(shù)據(jù)是評估細胞活力、代謝狀態(tài)、治療效果和預測疾病預后的重要基石。本文將重點介紹細胞增殖檢測中涉及的關鍵檢測項目、常用儀器、主流方法及其遵循的標準。

核心檢測項目

細胞增殖檢測的核心在于量化以下一個或多個方面：

細胞數(shù)量變化： 直接反映群體水平的增殖速率。
DNA合成速率： S期細胞比例的評估，是細胞進入分裂周期的直接標志。
代謝活性： 活細胞的整體代謝能力通常與其數(shù)量和活性成正比。
細胞周期分布： 分析處于G0/G1期、S期、G2/M期的細胞比例，間接反映增殖狀態(tài)。
細胞分裂次數(shù)追蹤： 標記母代細胞并追蹤其后代的分裂次數(shù)。

常用檢測儀器

根據(jù)不同的檢測原理和方法，需要借助多種儀器設備：

光學顯微鏡/倒置顯微鏡： 用于直接細胞計數(shù)（血球計數(shù)板）、觀察集落形成（克隆形成實驗）、形態(tài)學評估。
酶標儀/微孔板讀數(shù)儀： 最常用的儀器之一，用于讀取比色法（如MTT, CCK-8, XTT, SRB）、熒光法（如Alamar Blue, CFSE稀釋度初步分析）和化學發(fā)光法檢測的吸光度(OD)、熒光強度(FL)或發(fā)光值(RLU)，實現(xiàn)高通量、自動化檢測。
流式細胞儀： 功能強大的核心設備，用于精確分析BrdU/EdU摻入（DNA合成）、CFSE等增殖染料稀釋（分裂次數(shù)追蹤）、細胞周期分析（PI/DAPI染色）、特定增殖相關蛋白（如Ki67, PCNA）表達，并能結(jié)合其他參數(shù)進行多色分析。
自動化細胞計數(shù)器： 結(jié)合臺盼藍拒染法等，快速、客觀地進行細胞計數(shù)和活力分析。
液體閃爍計數(shù)器： 用于檢測放射性同位素標記物（如3H-胸苷）的摻入量（DNA合成）。
成像細胞分析系統(tǒng)/高內(nèi)涵分析系統(tǒng)： 結(jié)合顯微鏡和圖像分析軟件，進行基于圖像的高通量細胞計數(shù)、集落分析、EdU/BrdU摻入點計數(shù)等。

主要檢測方法

細胞增殖檢測方法多樣，各有優(yōu)缺點及適用場景：

1. DNA合成標志物摻入法

3H-胸苷摻入法： 經(jīng)典方法。細胞攝入放射性同位素3H標記的胸苷，摻入新合成的DNA中，通過液體閃爍計數(shù)檢測放射性強度。靈敏度高，但涉及放射性，操作繁瑣，使用受限。
BrdU (5-溴-2'-脫氧尿苷) 摻入法： 應用廣泛。BrdU類似胸苷摻入DNA。通過抗BrdU抗體進行免疫檢測（免疫熒光、免疫組化、流式細胞術、ELISA）。流式檢測可結(jié)合DNA染料進行細胞周期分析。
EdU (5-乙炔基-2'-脫氧尿苷) 摻入法： BrdU的改進。EdU含炔烴基團，可通過高效的“點擊化學”反應（如與熒光染料標記的疊氮化物共價結(jié)合）進行檢測。無需DNA變性（比BrdU步驟更簡單、更快、更靈敏），背景低。廣泛用于顯微成像和流式檢測。

2. 代謝活性檢測法

MTT法： 黃MTT被活細胞線粒體脫氫酶還原為紫色不溶性的甲臜(formazan)結(jié)晶，溶解后酶標儀測OD值（通常在570nm）。經(jīng)典、經(jīng)濟，但需要溶解步驟，且甲臜結(jié)晶形成受多種因素影響。
XTT法： 原理類似MTT，生成的甲臜是水溶性的，無需溶解步驟。靈敏度通常高于MTT。
MTS法： 與PMS（吩嗪硫酸甲酯）聯(lián)用，生成的甲臜直接水溶性，可直接檢測OD值（490nm）。操作簡便快捷。
CCK-8法： 主要成分是WST-8，在電子載體1-Methoxy PMS存在下，被細胞內(nèi)脫氫酶還原為高度水溶性的橙黃色甲臜染料?？芍苯訖z測OD值（450nm）。靈敏度高、毒性低、操作最簡便，應用非常廣泛。
Alamar Blue (Resazurin)法： 藍色非熒光的刃天青被活細胞還原為粉紅色熒光的試鹵靈。可通過酶標儀檢測熒光強度（Ex 560nm/Em 590nm）或吸光度變化（570nm和600nm）?？蛇B續(xù)監(jiān)測，對細胞無毒，通常無需終止反應。

3. 細胞增殖標志物檢測法

Ki67蛋白： 存在于增殖細胞（除G0期外）核內(nèi)的蛋白。常用免疫組化(IHC)、免疫熒光(IF)或流式細胞術檢測。是臨床病理評估腫瘤增殖活性的金標準之一。
PCNA (增殖細胞核抗原)： DNA聚合酶δ的輔助蛋白，在S期表達最高?？赏ㄟ^IHC、IF、流式檢測。

4. 細胞計數(shù)與集落形成法

直接計數(shù)法： 使用血球計數(shù)板或自動細胞計數(shù)器定期對細胞進行計數(shù)。直觀但工作量大，難以高通量。
克隆形成實驗： 低密度接種單細胞，培養(yǎng)一段時間后固定染色，計數(shù)>50個細胞的集落數(shù)。評估單個細胞的增殖潛力和藥物對群體增殖/生存的長期效應。

5. 細胞分裂示蹤法

CFSE (羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯) 染色： 熒光染料CFSE可自由進入細胞并與胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合。細胞分裂時，染料平均分配到子代細胞，熒光強度逐代減半。流式細胞術通過檢測熒光強度的稀釋程度，可精確追蹤細胞分裂的次數(shù)和動力學，計算增殖指數(shù)。
膜聯(lián)蛋白（如PKH26, CellTrace系列染料）： 原理類似CFSE的膜結(jié)合型熒光染料，同樣通過流式檢測分裂稀釋。

6. 細胞周期分析法

使用DNA染料（如碘化丙啶/PI, DAPI, Hoechst 33342）染色細胞核DNA，通過流式細胞儀分析DNA含量分布。處于S期的細胞比例增加通常提示增殖活躍?？膳cBrdU/EdU或增殖標志物進行雙參數(shù)分析。

關鍵檢測標準與規(guī)范

為了確保檢測結(jié)果的準確性、可靠性和可比性，需遵循相關標準和規(guī)范：

實驗設計：
- 嚴格設置對照組（陰性對照、陽性對照、空白對照）。
- 合理的細胞接種密度（避免接觸抑制或密度過低）。
- 明確的處理時間點和持續(xù)時間。
- 足夠的生物學重復和技術重復。
樣本處理：
- 無菌操作，避免污染。
- 細胞狀態(tài)良好（高活力，無支原體污染）。
- 處理因素（藥物濃度、刺激因子）準確配制，保證處理條件一致。