3.1動(dòng)物的選擇

    3周歲以上的健康中國產(chǎn)恒河猴作為實(shí)驗(yàn)的研究對象。由于恒河猴在自然條件下也存在一定比例的結(jié)核分枝桿菌的感染，為此對進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的恒河猴需要進(jìn)行體檢。最主要的一項(xiàng)是進(jìn)行OT測試。舊結(jié)核菌素試驗(yàn)采取猴外眼瞼皮內(nèi)注射的方式，注射0.1mL舊結(jié)核菌素。猴麻醉后，在猴的右上眼瞼皮內(nèi)注射舊結(jié)核菌素（Colorado Serum Company生產(chǎn)的Tuberculin Mammalian, Human Isolates Intrademic）0.1mL，注射后24h，48h，72h觀察實(shí)驗(yàn)猴的舊結(jié)核菌素反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)前3只恒河猴未出現(xiàn)紅腫反應(yīng)，舊結(jié)核菌素反應(yīng)陰性。

3.2動(dòng)物的飼養(yǎng)和運(yùn)輸

經(jīng)OT和X光檢測結(jié)核陰性的動(dòng)物可以進(jìn)入ABSL-3實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物麻醉后正常途徑進(jìn)入。進(jìn)入負(fù)壓猴籠飼養(yǎng)。常規(guī)猴糧，高壓滅菌水，每日飼以半個(gè)蘋果。溫度和濕度以及光照條件為常規(guī)ABSL-3實(shí)驗(yàn)室條件。

感染后猴子的運(yùn)輸采用專用猴運(yùn)輸箱，操作參考感染猴運(yùn)送SOP。

3.3結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)備

結(jié)核分枝桿菌的復(fù)蘇 從ATCC購買的Erdman菌株（ATCC35810）或結(jié)核耐藥株（內(nèi)部編號(hào)94789），自-80℃冰箱取出，融化，用7H9液體培養(yǎng)基稀釋，分裝。取稀釋后的Erdman菌液接種L-J培養(yǎng)基斜面，100μL/支，37℃培養(yǎng)3周，菌落長至合適大小。在斜面上加3-4mL 7H9培養(yǎng)基，將菌落自斜面上輕輕刮下，轉(zhuǎn)移至研磨器中，研磨均勻，將研磨好的菌液適當(dāng)稀釋，分裝，去一管轉(zhuǎn)接到L-J斜面生長用于菌落計(jì)數(shù)，其余菌放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4恒河猴的麻醉和復(fù)蘇

在進(jìn)行纖支鏡和X光檢測時(shí)由于操作時(shí)間較長，需要使用長效麻藥復(fù)方氯胺酮麻醉動(dòng)物，用生理鹽水1：5稀釋麻藥，稀釋液按照每公斤體重0.1ml的標(biāo)準(zhǔn)肌肉注射麻藥，麻醉動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后肌肉注射蘇醒劑蘇醒3號(hào)。具體操作參考SOP。

3.5纖維支氣管鏡的感染操作

動(dòng)物平放于手術(shù)車上，固定四肢。長時(shí)間操作需要給動(dòng)物吸氧。按照纖維支氣管鏡儀器操作規(guī)則，在麻醉動(dòng)物的齒間放入咬合器，通過咬合器從舌與上腭間插入支氣管鏡，注意觀察監(jiān)視器，找到聲門裂，小心插入支氣管鏡，進(jìn)入氣管后通過纖支鏡給藥通道注入2ml利多卡因（注射用）。

繼續(xù)向下，轉(zhuǎn)入右側(cè)肺至下葉位置。插入感染用纖支鏡噴灑導(dǎo)管，感染劑量100CFU。使用5mL注射器推入2mL菌液，之后再推入3mL空氣，排盡注射導(dǎo)管內(nèi)的殘余菌液。將纖支鏡連同注射管一同取出，進(jìn)行清洗。清洗程序注射管推入5mL生理鹽水，再推入消毒酒精5ml，推入清水5ml，推入生理鹽水5ml。取出注射管，纖支鏡用生理鹽水清洗。

檢測感染結(jié)核分枝桿菌數(shù)量，感染用菌液經(jīng)L-J斜面培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

3.6動(dòng)物靜脈取血

麻醉動(dòng)物剪去肘部猴毛，暴露皮膚。酒精面擦拭皮膚表面消毒。5ml注射器靜脈采血，取抗凝血和自凝血。分別分離細(xì)胞和血清，進(jìn)行下列血沉、CRP、細(xì)胞因子、流式細(xì)胞學(xué)抗結(jié)核抗體等實(shí)驗(yàn)。血清分離后凍存于低溫冰箱。

3.7動(dòng)物體溫測定

體溫芯片的植入：準(zhǔn)備好芯片掃描儀,檢查是否有電，給體溫芯片編號(hào)，將芯片錄入。麻醉動(dòng)物后，選擇后頸部或上臂近后肩處，酒精棉消毒后，提起皮膚，在皮下植入體溫芯片，檢查芯片固定的位置，是否脫出，消毒進(jìn)針口。用芯片掃描一下檢驗(yàn)是否正常。

3.8動(dòng)物的胸部X光檢查

檢查的頭一天晚上實(shí)驗(yàn)猴禁水食，檢查當(dāng)天對動(dòng)物進(jìn)行麻醉，用數(shù)字X光機(jī)檢查肺部。使用的參數(shù)如下：

選擇狗的模式，設(shè)置參數(shù) 高度：64cm，厚度：12cm電壓：50kv 電流：1.8~2.4mA之間, 根據(jù)猴的大小，固定電壓值，調(diào)電流。

3.9 CT

檢查的頭一天晚上實(shí)驗(yàn)猴禁水食，檢查當(dāng)天對動(dòng)物進(jìn)行麻醉，用數(shù)字X光機(jī)檢查肺部。

在人用的CT機(jī)器上選擇幼兒參數(shù)模式，調(diào)節(jié)電壓和電流使圖像分辨率達(dá)到要求，如電壓為120kv,電流為350mA。設(shè)置參數(shù)建立三維圖, 圖像存儲(chǔ)為dicom格式，用軟件計(jì)算病變的體積。

3.10 CRP檢測

取全血2ml于血清管中，4℃ 3000rpm離心20min分離血清。血清中C-反應(yīng)蛋白測定按照MONKEY C-REACTIVE PROTEIN(CRP) ELISA TEST KIT說明書進(jìn)行操作，結(jié)果以ng/ml表示。具體步驟為：按要求重懸標(biāo)準(zhǔn)品后，依次稀釋成75ng/ml，37.5 ng/ml，18.75 ng/ml，9.38 ng/ml，4.69 ng/ml，2.34 ng/ml，1.17 ng/ml和0 ng/ml。將各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和1:1000稀釋后的動(dòng)物血清分別加至已包被抗體的96孔板中，100ul/孔。室溫孵育45min，洗板后每孔加HRP標(biāo)記的檢測抗體100ul。室溫孵育45min后，洗板，加TMB 100ul/孔進(jìn)行顯色。室溫避光顯色20min后加終止液，于450nm處讀取OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每只動(dòng)物感染后不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血清中的C-反應(yīng)蛋白含量。

3.11血沉檢測

恒河猴麻醉后，取全血1.6ml于檸檬酸鈉抗凝的血沉管中，顛倒混勻5—8次，垂直插在血沉架上，將血沉管血液的液面與血沉架上的0刻度線對齊，室溫靜置1h后觀察紅細(xì)胞下降的mm數(shù)。

3.12血清中結(jié)核抗體（IgG）的檢測

    按照結(jié)核分枝桿菌抗體診斷試劑盒（膠體金法）使用說明書進(jìn)行操作：將試劑和反應(yīng)板取出平衡至室溫，反應(yīng)板上依次標(biāo)號(hào)。在每個(gè)反應(yīng)孔中加2滴封閉液，待吸收完全后分別加入分離的血清各40ul，之后每孔加入洗滌液各6滴，待吸收完全后每孔加2滴金標(biāo)液進(jìn)行顯色。最后每孔加入6滴洗滌液，待吸收完全后目測結(jié)果。結(jié)果的判定以質(zhì)控點(diǎn)和反應(yīng)孔中間同時(shí)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽性，若質(zhì)控點(diǎn)顯示紅色，反應(yīng)孔中間無紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)或僅為痕跡者為陰性。