C57BL/6J小鼠

包括實驗材料（實驗動物、試劑、儀器）、實驗環(huán)境、細胞培養(yǎng)/載體構建/蛋白表達/病原培養(yǎng)鑒定方法、實驗操作規(guī)程、動物處理倫理等內容。

（一）GPR68 Ko小鼠的構建

1、實驗設計

根據GPR68蛋白保守區(qū)和基因組結構，設計需要刪除的外顯子。GPR68基因存在多種轉錄產物，但根據GPR68基因組結構和蛋白功能保守區(qū)，只有一個蛋白編碼區(qū)exon1。因此在exon1的兩邊設計gRNA靶點，將exon1進行全身性敲除。

圖2 插入位點設計

2、Cas9/gRNA的活性檢測

采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒檢測gRNA靶點體外酶切活性。選體外活性高的gRNA顯微注射受精卵，取胚胎檢測內源活性。根據Cas9/gRNA的內源活性結果，選用活性較高的gRNA進行后續(xù)實驗。

3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配

選取活性高的CRISPR體外轉錄成RNA，顯微注射到小鼠受精卵中，得到發(fā)生基因突變的首建者小鼠（founder）。對小鼠進行基因型鑒定，獲得發(fā)生期望突變的founder小鼠。通過基因組DNA的PCR進行基因型的鑒定，若發(fā)生DNA片段刪除，將出現特異的縮短的PCR產物。

4、穩(wěn)定遺傳的Gpr68敲除小鼠品系的建立

將帶有突變的founder小鼠與野生型小鼠交配，得到基因突變的雜合子小鼠（+/-）F1代，并進行DNA測序，確認目標基因發(fā)生的DNA片段刪除，從而目標蛋白被失活，實現基因敲除。

基因型相同的雜合子小鼠（+/-）相互交配，得到基因敲除的純合子小鼠（-/-）F2代。大約有1/4幾率的F2后代小鼠是基因敲除的純合體小鼠。

（二）皮下移植黑色素瘤模型的構建

1、用0.25%胰酶消化細胞收集細胞懸液，用預冷的PBS重懸細胞，1000rpm離心5min，洗滌細胞兩次，除去單細胞懸液中的血清。

2、對細胞進行計數，用PBS稀釋細胞至濃度為2.5×10⁶個/mL，接種體積控制在0.2mL。

3、采用1mL無菌注射器于小鼠腋下部位接種細胞。接種時將單細胞懸液充分混勻，防止細胞成團導致活性降低以及接種細胞數不均，左手固定小鼠，右手執(zhí)注射器，針頭在皮下穿行時避免刺破皮膚與肌肉，到達接種位點并注射完畢后退出針頭時避免細胞懸液溢出。

4、每3天用游標卡尺測量腫瘤大小，測量腫瘤最長和最短直徑。腫瘤體積計算公式為V=a×b²/2(a為長軸，b為短軸)。

5、接種后第20天實驗結束，采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出腫瘤組織，稱量小鼠腫瘤重量、脾臟重量。

在無特殊刺激的情況下，GPR68-/-小鼠沒有明顯表型，且外觀與同背景WT小鼠無明顯差異。分別從DNA、mRNA、蛋白水平檢測GPR68-/-小鼠組織中GPR68表達，如圖3所示，在此三個水平上均不能檢測到GPR68。

圖3 鑒定GPR68-/-小鼠組織中GPR68的表達

a.鼠尾DNA的鑒定；b.脾臟T細胞的mRNA鑒定；c.脾臟T細胞的蛋白鑒定

分別對WT與GPR68-/-小鼠進行皮下注射接種5×10⁵個B16細胞，觀察并檢測腫瘤生長情況。接種后第20天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，稱量小鼠腫瘤重量、脾臟重量。如圖4所示，與WT小鼠比較，GPR68-/-小鼠能夠明顯抑制黑色素瘤的發(fā)展，GPR68-/-小鼠脾臟增大，但二者體重無明顯差異.

圖4 GPR68敲除對黑色素瘤生長的抑制作用