實(shí)驗(yàn)動物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠

試劑：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA

儀器：冰凍切片機(jī)，leica DMI8活細(xì)胞工作站

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：將Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系與Stat5 或 icS5 floxed小鼠雜交，分別為對照組（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；實(shí)驗(yàn)1組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；實(shí)驗(yàn)2組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周齡時，提取雜交小鼠鼠尾DNA，通過凝膠電泳檢測小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(擴(kuò)增目的片段長174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR條件：預(yù)變性94℃3min；94℃變性30s，66℃復(fù)性1min，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。選取雙陽性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。實(shí)驗(yàn)組小鼠按100mg/kg體重腹腔注射他莫昔芬，對照組小鼠注射等量的玉米油。通過 Tam 誘導(dǎo)， 然后分別在 12 小時和 1, 3, 5, 7, 30， 122和280天麻醉處死各組小鼠。分別取結(jié)腸、空腸、回腸組織，用冷PBS沖洗腸道組織，縱向剖開，放入多聚甲醛中固定過夜，制作冰凍切片在子代腸上皮細(xì)胞中追蹤檢測是否去除 Stat5 或活化 STAT5 能夠改變腸上皮中的tdToamto 信號強(qiáng)度和位置.

1、 基因鑒定信息

圖1  Lgr5, Rosa26tdTomato基因凝膠電泳鑒定結(jié)果