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一、模型設(shè)計原理：
GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復(fù)方式進行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠與組織特異性表達Cre小鼠交配，從而實現(xiàn)Drd5基因條件性敲除的目的。實驗采用最新的spCas91.1進行注射，減少了基因組中的off-Target。
根據(jù)Drd5基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)分析可知：Exon2（aa1-478）為公共外顯子，位于蛋白功能保守區(qū)上：7tm_GPCRs superfamily domain，條件性刪除這個外顯子后，將破壞7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此決定在Exon1的兩邊定點插入FloxP位點，實現(xiàn)將Exon1條件性敲除。
1）GRNA靶點設(shè)計及活性檢測
在要刪除的Exon1外顯子兩端，設(shè)計gRNA靶點如下
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靶點名稱 |
靶點序列（標(biāo)灰為PAM序列） |
活性分析 |
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Drd5-L1 |
GCGCGCTGCCGACAGGATCGG |
10% |
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Drd5-L2 |
TCCCATCCTGGGGACTAGAGG |
60% |
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Drd5-L3 |
GCAGGGTGAGCGCCCCTCGGG |
40% |
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Drd5-L4 |
TGACCGTCCCCAGACCCGAGG |
50% |
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Drd5-R1 |
TGTTCTGTGACTTGCACCTGG |
95% |
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Drd5-R2 |
GAGTGGCAATTGCTGGTATGG |
95% |
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Drd5-R3 |
GCAGCAGCCCGAGAACAGGGG |
85% |
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Drd5-R4 |
TTTCTCCCTGATTTGTTGTGG |
85% |
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Drd5-R5 |
CACTTTCTCGTCTCTAAAGGG |
95% |
使用Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒（貨號：VK007）進行g(shù)RNA體外活性檢測，結(jié)果如下：
gRNA靶點活性檢測結(jié)果
靶點活性數(shù)據(jù)分析如下：
根據(jù)活性檢測結(jié)果，我們選用活性最高的L2,R1進行F0代首建鼠構(gòu)建。
2）PCR結(jié)果分析
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擴增說明 |
引物名稱 |
引物序列（5’-3’） |
PCR產(chǎn)物大小 |
使用如下引物進行目的條帶擴增
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兩端floxp插入 |
F |
CTGGGCTTGGGGCGAGGGTAT |
KI-floxp：2564 bp |
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測序 |
R |
GAGAAACACTGAGCACCAACTG |
WT：2496 bp |
M-CKO-M30 (1-19,NC)目的帶擴增瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如下圖：
M：BM2000 Marker，如右圖所示
NC:陰性對照
如圖所示，5♂擴出目的條帶
3）Drd5floxp/flox小鼠測序結(jié)果分析
以M-CKO-M30-5小鼠測序結(jié)果為例，測序結(jié)果標(biāo)注如下：
5’端FloxP比對結(jié)果：
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