C57BL/6小鼠

一、模型設計原理：

GRNA介導Cas9蛋白剪切目標外顯子兩端的內含子DNA，同時提供同源模板Donor，基因組兩端通過同源重組修復方式進行DNA修復，在特定外顯子兩端插入FloxP。CCKBR-FloxP小鼠與組織特異性表達Cre小鼠交配，從而實現CCKBR基因條件性敲除的目的。實驗采用最新的spCas91.1進行注射，減少了基因組中的off-Target。

根據CCKBR基因組結構和蛋白功能保守區(qū)分析在Exon1的兩邊定點插入FloxP位點，實現將Exon1條件性敲除。

二、模型設計過程：

1)CCKBR基因GRNA靶點設計及活性檢測

在要刪除的Exon1外顯子兩端，設計gRNA靶點如下：

Cckbr-L1: GCTTAGTTGGAGCTGAGTGGG

Cckbr-L2: TGCTGGAGCTAGCTTAGTTGG

Cckbr-L3: AGCAGGTGGAACCGGTGCTGG

Cckbr-L4: CGCGGGAGCAGGTGGAACCGG

Cckbr-R1: GGACCTAGGTGGGAGCTGAGG

Reverse Complement: CCTCAGCTCCCACCTAGGTCC

Cckbr-R2: GAGGGGAGGGACCTAGGTGGG

Reverse Complement: CCCACCTAGGTCCCTCCCCTC

Cckbr-R3: TTGGAGTCAGGAGAGCTTGGG

Reverse Complement: CCCAAGCTCTCCTGACTCCAA

Cckbr-R4: TGTGAAGGTGTTGGAGTCAGG

Reverse Complement: CCTGACTCCAACACCTTCACA

使用Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒（貨號：VK007）進行gRNA體外活性檢測，結果如下：

gRNA靶點活性檢測結果分析如下：

2）CCKBR^flox/flox,villin Cre小鼠設計

3）CCKBR^flox/flox,villin Cre小鼠模型的繁育及鑒定結果：

CCKBR^floxp/flox小鼠與Cre 的小鼠（villin Cre）雜交，對后代自交獲得的小鼠進行基因型鑒定，成功獲得CCKBR腸道上皮細胞條件性基因敲除小鼠CCKBR^flox/flox,villin Cre）。見下圖

經鑒定12#: CCKBR^flox/flox,villin Cre

CCKBR^fl/fl; Villin Cre小鼠結果分析