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PCR檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-25 08:49:03 更新時(shí)間：2025-07-24 22:11:13

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

PCR檢測(cè)的重要性和背景介紹

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)檢測(cè)作為現(xiàn)代分子生物學(xué)最核心的技術(shù)之一，已成為疾病診斷、法醫(yī)鑒定、食品安全監(jiān)控和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域不可或缺的檢測(cè)手段。該技術(shù)由Kary Mullis于1983年發(fā)明，其通過(guò)模擬DNA自然過(guò)程，能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)將特定DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，實(shí)現(xiàn)微量核酸樣本的高靈敏度檢測(cè)。在臨床醫(yī)學(xué)中，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)（如新冠病毒、HIV、HBV等）、遺傳病篩查和腫瘤基因突變分析；在科研領(lǐng)域，它是基因表達(dá)分析、基因克隆和測(cè)序的重要工具；在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，PCR檢測(cè)為食源性致病菌監(jiān)測(cè)、轉(zhuǎn)基因成分鑒定等提供了可靠的技術(shù)支持。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR等新技術(shù)的涌現(xiàn)，PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性、特異性和應(yīng)用范圍得到持續(xù)拓展。

檢測(cè)項(xiàng)目和范圍

PCR檢測(cè)主要針對(duì)以下項(xiàng)目：1)病原微生物核酸檢測(cè)（包括細(xì)菌、病毒、真菌等）；2)遺傳性疾病相關(guān)基因突變；3)腫瘤標(biāo)志物及用藥指導(dǎo)基因；4)轉(zhuǎn)基因生物成分；5)法醫(yī)DNA鑒定。檢測(cè)樣本類型涵蓋血液、組織、唾液、尿液、環(huán)境拭子等多種生物材料。根據(jù)檢測(cè)目的不同，可分為定性PCR（檢測(cè)特定序列是否存在）、定量PCR（測(cè)定目標(biāo)DNA拷貝數(shù)）和突變檢測(cè)PCR（識(shí)別特定基因變異）。近年來(lái)，多重PCR技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，顯著提高了檢測(cè)效率。

使用的檢測(cè)儀器和設(shè)備

PCR檢測(cè)系統(tǒng)主要包括：1)熱循環(huán)儀（PCR儀）：提供精確的溫度循環(huán)控制，主流型號(hào)包括ABI 7500、Bio-Rad CFX96等；2)核酸提取設(shè)備：如MagNA Pure、QIAcube等自動(dòng)化提取系統(tǒng)；3)電泳系統(tǒng)：用于常規(guī)PCR產(chǎn)物分析；4)實(shí)時(shí)熒光PCR儀：如ABI QuantStudio系列，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程；5)超微量分光光度計(jì)或熒光計(jì)（如NanoDrop）用于核酸濃度測(cè)定。輔助設(shè)備包括生物安全柜、離心機(jī)、超純水系統(tǒng)等。數(shù)字PCR系統(tǒng)如Bio-Rad QX200可提供絕對(duì)定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室還需配備-20℃和-80℃冰箱用于試劑和樣本保存。

標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法和流程

標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)流程包括：1)樣本采集與處理：按規(guī)范采集樣本并立即處理或低溫保存；2)核酸提?。菏褂蒙唐坊噭┖谢蜃詣?dòng)化提取儀獲取高質(zhì)量核酸；3)反應(yīng)體系配制：包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、緩沖液等，嚴(yán)格防止污染；4)PCR擴(kuò)增：設(shè)置預(yù)變性（95℃ 2-5min）、變性（95℃ 15-30s）、退火（溫度依引物而定，30-60s）、延伸（72℃ 30-60s/kb）等步驟，循環(huán)30-40次；5)產(chǎn)物分析：實(shí)時(shí)熒光PCR可直接讀取結(jié)果，常規(guī)PCR需通過(guò)電泳或測(cè)序驗(yàn)證。對(duì)于臨床診斷，需設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)部質(zhì)控，全程遵循質(zhì)量保證程序。

檢測(cè)結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

PCR檢測(cè)結(jié)果判讀需綜合考慮：1)擴(kuò)增曲線：實(shí)時(shí)PCR應(yīng)有典型的S形曲線，Ct值≤40（視試劑盒而定）；2)溶解曲線：?jiǎn)我环灞砻鲾U(kuò)增特異性好；3)電泳條帶：大小與預(yù)期相符且無(wú)非特異性條帶；4)質(zhì)控樣本：陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)檢出，陰性對(duì)照和無(wú)模板對(duì)照應(yīng)無(wú)擴(kuò)增。定量檢測(cè)需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.98方可用于計(jì)算拷貝數(shù)。臨床報(bào)告應(yīng)注明檢測(cè)方法、檢出限和結(jié)果解釋，如"新冠病毒ORF1ab基因和N基因檢測(cè)陽(yáng)性（Ct值分別為28.5和30.2）"?？梢山Y(jié)果需重復(fù)檢測(cè)或采用其他方法驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加CAP、EMQN等外部質(zhì)評(píng)以保證結(jié)果可靠性。