您現(xiàn)在的位置：首頁 > 檢測(cè)項(xiàng)目 > 其他檢測(cè)

噬菌體檢測(cè)

1對(duì)1客服專屬服務(wù)，免費(fèi)制定檢測(cè)方案，15分鐘極速響應(yīng)

可選形式：電子報(bào)告紙質(zhì)報(bào)告

可選語言：中文報(bào)告英文報(bào)告

發(fā)布時(shí)間：2025-07-25 08:49:03 更新時(shí)間：2025-07-25 08:26:17

點(diǎn)擊：0

作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

噬菌體（Bacteriophage）是特異性感染細(xì)菌的病毒，在生物防控、臨床治療、食品工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其檢測(cè)需圍繞 效價(jià)測(cè)定、宿主特異性、遺傳穩(wěn)定性、安全性 四大核心展開，確保噬菌體的活性、靶向性及合規(guī)性。以下是噬菌體檢測(cè)的關(guān)鍵方法與技術(shù)要點(diǎn)：

一、效價(jià)測(cè)定（噬斑形成單位，PFU/mL）

雙層瓊脂噬斑法（經(jīng)典方法）
- 步驟：
  1. 宿主菌液（OD???≈0.4）與噬菌體梯度稀釋液混合；
  2. 加入軟瓊脂（0.7%），傾注于底層瓊脂平板；
  3. 37℃孵育6-24小時(shí)，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)。
- 計(jì)算公式：PFU/mL = 噬斑數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 1/接種體積（mL）。
- 靈敏度：可檢測(cè)≥10 PFU/mL（GB/T 38505）。
qPCR定量法（快速檢測(cè)）
- 靶基因選擇：噬菌體特異性基因（如T4的gp23，λ的cos位點(diǎn)）；
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線：已知濃度噬菌體DNA梯度稀釋，R²≥0.99；
- 限值：檢測(cè)下限達(dá)1×10² 基因組拷貝/mL（ISO 22174）。

二、宿主特異性與裂解譜檢測(cè)

宿主范圍測(cè)定
- 點(diǎn)斑法：將噬菌體液滴加于宿主菌苔，觀察裂解圈（直徑≥2mm為陽性）；
- 交叉感染測(cè)試：檢測(cè)噬菌體對(duì)非目標(biāo)菌（如益生菌、人體共生菌）的裂解活性。
效率與潛伏期
- 一步生長曲線：測(cè)定潛伏期（20-60分鐘）和裂解量（Burst size，50-200 PFU/細(xì)胞）；
- 抑菌動(dòng)力學(xué)：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)宿主菌OD???下降速率（ASTM E2871）。

三、遺傳與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測(cè)

基因組完整性
- 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）：檢測(cè)DNA大?。ㄈ鏣4噬菌體≈169kbp）；
- 全基因組測(cè)序（WGS）：Illumina/Nanopore平臺(tái)，驗(yàn)證基因無突變（如CRISPR抗性基因）。
結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性
- 透射電鏡（TEM）：觀察衣殼形態(tài)（二十面體/絲狀）及尾部結(jié)構(gòu)（收縮/非收縮）；
- 熱穩(wěn)定性：60℃處理1小時(shí)，效價(jià)保留≥90%（適用于熱穩(wěn)定噬菌體制劑）。

四、安全性與合規(guī)性檢測(cè)

內(nèi)毒素與雜質(zhì)
- 內(nèi)毒素檢測(cè)（LAL法）：≤5 EU/mL（靜脈用噬菌體制劑，USP <85>）；
- 宿主菌殘留DNA：≤10 ng/劑量（qPCR定量，F(xiàn)DA CBER指南）。
生物安全性
- 細(xì)胞毒性：MTT法檢測(cè)噬菌體對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性（IC??≥1×10¹? PFU/mL）；
- 動(dòng)物模型：小鼠靜脈注射后無急性炎癥反應(yīng)（OECD 420）。
環(huán)境釋放風(fēng)險(xiǎn)
- 環(huán)境持久性：檢測(cè)噬菌體在土壤/水體中的存活時(shí)間（PCR追蹤，EPA GLP標(biāo)準(zhǔn)）；
- 基因水平轉(zhuǎn)移：驗(yàn)證無質(zhì)粒/轉(zhuǎn)座子攜帶抗生素抗性基因。

五、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與限值

檢測(cè)項(xiàng)目	國際標(biāo)準(zhǔn)	國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)	典型限值
噬菌體效價(jià)（PFU/mL）	ISO 10705-1	GB/T 38505	≥1×10? PFU/mL（治療級(jí)）
內(nèi)毒素	USP <85>	ChP 2020	≤5 EU/mL
宿主菌殘留DNA	FDA CBER	NIFDC指南	≤10 ng/劑量
熱穩(wěn)定性	EP 2.6.27	YY/T 1612	效價(jià)保留≥90%（60℃/1h）

六、常見問題與改進(jìn)措施

問題現(xiàn)象	可能原因	解決方案
噬斑不清晰/融合	宿主菌過密或噬菌體濃度過高	調(diào)整宿主菌OD???至0.3-0.5，優(yōu)化稀釋梯度
qPCR假陽性	環(huán)境DNA污染或引物二聚體	添加UDG酶防污染，設(shè)計(jì)探針法（TaqMan）
效價(jià)快速衰減	儲(chǔ)存溫度不當(dāng)或反復(fù)凍融	添加保護(hù)劑（甘油/海藻糖），-80℃單次分裝儲(chǔ)存
宿主范圍過廣	噬菌體尾絲蛋白非特異性結(jié)合	基因工程改造尾絲蛋白（定向進(jìn)化篩選）

七、檢測(cè)流程建議

研發(fā)階段
- 宿主篩選：測(cè)試噬菌體對(duì)臨床分離株（如抗生素耐藥菌）的裂解效率；
- 遺傳穩(wěn)定性：連續(xù)傳代20次，檢測(cè)基因組突變率（WGS）。
生產(chǎn)質(zhì)控
- 效價(jià)批檢：每批次抽檢3份樣品（雙層瓊脂法+qPCR）；
- 無菌檢測(cè)：膜過濾法（0.22μm）驗(yàn)證無雜菌污染（EP 2.6.1）。
臨床前驗(yàn)證
- 藥效學(xué)：小鼠菌血癥模型驗(yàn)證噬菌體清除效率（Log CFU降低≥3）；
- 藥代動(dòng)力學(xué)：檢測(cè)噬菌體在血液/組織中的半衰期（qPCR追蹤）。