大鼠哮喘模型的分組及建立
實驗大鼠分組：
根據(jù)隨機化原則，將24只雄性Wistar大鼠(體重190-250g) 按體重編號，采取隨機排列表法分為以下4組：(1)正常對照組、(2)哮喘一周組(激發(fā)一周)、(3)哮喘兩周組(激發(fā)二周)和(4)哮喘四周組(激發(fā)四周及以上)。
哮喘模型的建立：
第一天三組哮喘組大鼠每只大腿內(nèi)側(cè)皮下注射OVA懸液1ml(OVA10mg+氫氧化鋁200mg+0.9%生理鹽水至1ml)，同時腹腔內(nèi)注射滅活百日咳桿菌懸液1ml (約6*109個菌株)作為佐劑,第8天重復(fù)致敏一次，第15天開始將大鼠置于自制玻璃容器中，隔日用402超聲霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)給于中等霧量的2%的OVA懸液50ml激發(fā)30分鐘，每周至少3次，分別按分組激發(fā)1周、2周和4周及以上。OVA懸液激發(fā)后以大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快、行動遲緩或俯伏不動等癥狀以及肺內(nèi)組織病理切片顯示嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，小氣道和小血管收縮為哮喘激發(fā)成功。
正常對照組腹腔內(nèi)注射等量PBS1ml代替OVA懸液,2周后霧化吸入中等霧量的PBS液50ml共30min,每天一次，共15天。
T 淋巴細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)
對各組大鼠無菌操作行腸系膜下靜脈穿刺采血10ml,分裝于離心管后用等量PBS液稀釋，然后緩慢加于等體積的淋巴細(xì)胞分離液上，使形成層次分明的界面。
2200rpm離心20分鐘，可見層次分明的界面。吸出離心管中間的一層乳白色的液體，加入0.85%的氯化銨以破碎紅細(xì)胞并室溫靜置2分鐘，然后用PBS終止反應(yīng)。 室溫1800rpm離心10分鐘，去除上清。
繼續(xù)用PBS稀釋液先后洗滌2次，每次1600rpm離心15分鐘;
去除上清后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將沉淀調(diào)至1ml并輕輕吹打混勻，置37℃，5%CO2 溫箱孵育1小時;
將細(xì)胞懸液進一步用無菌尼龍棉柱37℃，5%CO2 溫箱培養(yǎng)1小時，分離出T細(xì)胞，臺盼蘭染色試驗活細(xì)胞〉90%;
用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整T細(xì)胞濃度為2*106/ml,接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔各1ml,于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
CMA認(rèn)證
檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實驗室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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