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RIP(RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀)

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發(fā)布時間：2024-05-21 08:15:32 更新時間：2025-02-18 14:34:20

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　　RIP(RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀)

　　用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白。防止非特異性的RNA的結(jié)合。免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來。結(jié)合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。

RIP 技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀）主要是運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物

沉淀下來，經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測序分析。RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄

后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)

合物，RIP實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件與ChIP實(shí)驗(yàn)不太相同，如：RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等等。

RIP實(shí)驗(yàn)步驟

一、獲取細(xì)胞裂解液

冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞兩次
加入冷PBS后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來，收集至eppendoff管
1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細(xì)胞
用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞，吹打均勻后于冰上靜置5min
每管分裝200μl細(xì)胞裂解液，貯存于-80℃

二、制備磁珠-抗體

重懸磁珠
標(biāo)記實(shí)驗(yàn)所需的eppendoff管
吸取50μl 重懸后的磁珠懸液于每個eppendoff管
每管加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩
將eppendoff管置于磁力架上，去上清，重復(fù)一次
用100μl的RIP Wash Buffer重懸磁珠
室溫孵育30min
將eppendoff管置于磁力架上，棄上清
加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復(fù)一次
加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后置于冰上

三、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀

準(zhǔn)備RIP Immunoprecipitation Buffer
將前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
迅速解凍第一步制備的細(xì)胞裂解液，離心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗體復(fù)合物中，使得總體積為1ml
4℃孵育3h至過夜
短暫離心，將eppendoff管放在磁力架上，棄上清
加入500μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后將eppendoff管放在磁力架上，棄上清，重復(fù)清洗6次

四、RNA純化

準(zhǔn)備Proteinase K Buffer。每個樣品需150ul
用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復(fù)合物
55℃孵育30min
孵育完之后，將enpendoff管置于磁力架上，將上清液吸入一新的enpendoff管中
于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer
于每管加入400μl苯酚：氯仿：異戊醇，渦旋震蕩，室溫下14,000rpm離心10min
小心吸取350μl上層水相，吸入另一新的enpendoff管
于每管加入400μl氯仿，渦旋震蕩15s，室溫下14,000rpm離心10min
小心的吸取300μl上層水相，吸入另一新的enpendoff管
每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 無水乙醇（無RNase），混合，-80℃保持1h至過夜
14,000rpm，4℃離心30min，小心去上清
用80%乙醇沖洗一次，14,000rpm，4℃離心15min，小心去上清，空氣中晾干.
10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存。