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眼刺激替代試驗(yàn)-熒光素漏出法檢測

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發(fā)布時間：2025-07-25 08:49:03 更新時間：2025-09-14 23:38:50

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

眼刺激替代試驗(yàn)-熒光素漏出法檢測概述

眼刺激替代試驗(yàn)-熒光素漏出法（Fluorescein Leakage Test）是一種基于體外模型評估化學(xué)物質(zhì)對眼部刺激性影響的非動物實(shí)驗(yàn)方法，被廣泛應(yīng)用于化妝品、藥品、醫(yī)療器械及工業(yè)化學(xué)品的安全性評價。傳統(tǒng)眼刺激試驗(yàn)依賴兔眼活體實(shí)驗(yàn)，存在倫理爭議和種屬差異性問題，而熒光素漏出法通過模擬角膜屏障功能損傷，利用熒光素鈉的滲透特性量化評估刺激性，具有靈敏度高、重復(fù)性好且符合“3R原則”（替代、減少、優(yōu)化）的特點(diǎn)。該方法的核心原理是：當(dāng)受試物質(zhì)破壞角膜上皮細(xì)胞層時，熒光素鈉可滲透至細(xì)胞間隙或深層組織，其滲漏程度與刺激性呈正相關(guān)，通過檢測熒光強(qiáng)度即可實(shí)現(xiàn)快速定量分析。

檢測項目

熒光素漏出法主要檢測以下項目：
1. 角膜屏障功能完整性：評估受試物質(zhì)對角膜上皮細(xì)胞間緊密連接的破壞程度；
2. 熒光素鈉滲透濃度：量化熒光素在角膜模型中的擴(kuò)散量；
3. 刺激性等級分類：根據(jù)熒光強(qiáng)度劃分無刺激、輕度刺激或嚴(yán)重刺激等級；
4. 時間依賴性損傷：分析不同暴露時間下的損傷動態(tài)變化。

檢測儀器

該試驗(yàn)需使用以下關(guān)鍵儀器：
1. 熒光分光光度計：用于精確測定熒光素鈉的發(fā)射光強(qiáng)度（激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長520nm）；
2. 角膜等效模型培養(yǎng)系統(tǒng)：如EpiOcular?或LabCyte CORNEA-MODEL等三維人工角膜組織；
3. 微孔板讀數(shù)儀：適用于高通量樣本檢測；
4. 倒置熒光顯微鏡：觀察熒光素在組織中的分布形態(tài)；
5. pH計與滲透壓儀：確保試驗(yàn)溶液的理化參數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)。

檢測方法

實(shí)驗(yàn)操作流程分為以下步驟：
1. 樣本預(yù)處理：將人工角膜模型用生理鹽水清洗并平衡至37℃；
2. 熒光素鈉負(fù)載：在模型表面施加含0.5%-1%熒光素鈉的受試物溶液，孵育30-60分鐘；
3. 孵育與清洗：去除未結(jié)合的熒光素，收集滲透液或直接測量模型內(nèi)熒光強(qiáng)度；
4. 熒光測定：使用分光光度計或顯微鏡定量分析滲漏量；
5. 數(shù)據(jù)分析：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算熒光素濃度，結(jié)合閾值判定刺激性等級。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

該方法遵循國際與國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，主要包括：
1. OECD TG 492：《體外角膜刺激性熒光素漏出試驗(yàn)指南》；
2. ISO 10993-10：醫(yī)療器械生物學(xué)評價中眼部刺激試驗(yàn)的替代方法要求；
3. GB/T 16886.10-2017：中國國家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于醫(yī)療器械的刺激試驗(yàn)部分；
4. ECVAM驗(yàn)證協(xié)議：歐洲替代方法驗(yàn)證中心對方法可靠性的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。
注：試驗(yàn)需設(shè)置陰性對照（生理鹽水）和陽性對照（1% SDS溶液），并滿足重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)≤15%。

總結(jié)

熒光素漏出法作為眼刺激評價的標(biāo)準(zhǔn)化替代方案，通過定量檢測角膜屏障損傷程度，顯著降低了動物使用率，同時兼具高效性與準(zhǔn)確性。其檢測結(jié)果的可靠性依賴于嚴(yán)格遵循儀器校準(zhǔn)、模型質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。隨著器官芯片技術(shù)和人工智能數(shù)據(jù)分析的融合，該方法將進(jìn)一步優(yōu)化，成為化學(xué)品安全性評估體系中的重要支柱。