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對(duì)蝦急性壞死性胰腺炎PCR檢測(cè)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-05-14 05:48:26 更新時(shí)間：2025-05-13 21:44:28

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

對(duì)蝦急性壞死性胰腺炎（AHPNS）及其檢測(cè)意義

對(duì)蝦急性壞死性胰腺炎（Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome, AHPNS），又稱早期死亡綜合征（EMS），是一種嚴(yán)重威脅對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的傳染性疾病。其病原體為攜帶特定毒力基因的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），可導(dǎo)致對(duì)蝦肝胰腺組織大面積壞死，死亡率高達(dá)90%以上。近年來(lái)，隨著全球?qū)ξr養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，AHPNS的快速、精準(zhǔn)檢測(cè)成為疾病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)診斷方法依賴病理學(xué)觀察和細(xì)菌培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度不足，而基于分子生物學(xué)的PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作便捷等優(yōu)勢(shì)，已成為AHPNS病原檢測(cè)的核心手段。

檢測(cè)項(xiàng)目

本次PCR檢測(cè)的核心目標(biāo)為副溶血弧菌中與AHPNS相關(guān)的毒力基因，包括但不限于： - pirA和pirB基因：編碼溶血毒素的關(guān)鍵毒力因子，是AHPNS的分子標(biāo)志物； - toxR或tlh基因：作為副溶血弧菌種屬特異性基因，用于輔助驗(yàn)證病原體類型。

檢測(cè)儀器

PCR檢測(cè)需使用以下關(guān)鍵儀器設(shè)備： - 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（qPCR）：支持高靈敏度擴(kuò)增與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)； - 核酸提取儀：用于蝦組織或水體樣本中DNA的高效純化； - 微型離心機(jī)與電泳系統(tǒng)：用于樣本前處理及PCR產(chǎn)物驗(yàn)證； - 生物安全柜：確保實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)污染環(huán)境。

檢測(cè)方法

檢測(cè)流程包括以下步驟： 1. 樣本采集：取對(duì)蝦肝胰腺組織或養(yǎng)殖水體樣本，低溫保存運(yùn)輸； 2. 核酸提取：使用酚-氯仿法或商用試劑盒提取總DNA； 3. 引物設(shè)計(jì)：針對(duì)pirA/pirB基因設(shè)計(jì)特異性引物（如引物序列：pirA-F:5'-ATGGCAA…-3'，pirA-R:5'-TTAGTC…-3'）； 4. PCR擴(kuò)增：設(shè)置反應(yīng)體系（Taq酶、dNTPs、緩沖液等），循環(huán)條件為預(yù)變性（94℃, 5min）→35輪擴(kuò)增（94℃/30s, 55℃/30s, 72℃/30s）→終延伸（72℃, 5min）； 5. 電泳分析：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察目標(biāo)條帶（預(yù)期片段長(zhǎng)度約300-500bp），結(jié)合熒光定量結(jié)果判定陽(yáng)性樣本。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

本檢測(cè)遵循以下國(guó)際及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)： - OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》：規(guī)定AHPNS的分子診斷流程與結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)； - ISO 22118:2011：規(guī)范PCR檢測(cè)的靈敏度、特異性及重復(fù)性要求； - 陽(yáng)性對(duì)照：使用已知攜帶pirA/pirB基因的副溶血弧菌菌株作為對(duì)照，確保檢測(cè)體系有效性； - 質(zhì)量控制：每批次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板DNA）和空白對(duì)照（無(wú)引物），排除污染及假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。

通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)化流程，PCR檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)對(duì)蝦樣本中AHPNS病原體的快速、精準(zhǔn)篩查，為養(yǎng)殖場(chǎng)的疾病預(yù)警和防控提供科學(xué)依據(jù)。