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流行性造血器官壞死病毒病毒分離與分子生物學(xué)檢測檢測

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-25 08:49:03 更新時(shí)間：2025-07-24 22:15:46

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

流行性造血器官壞死病毒概述

流行性造血器官壞死病毒（Epizootic Hematopoietic Necrosis Virus, EHNV）是一種主要感染淡水魚類的致命病原體，尤其對(duì)虹鱒魚、銀鱸等經(jīng)濟(jì)魚種危害極大。該病毒可通過水體、受污染餌料或接觸傳播，引起造血組織壞死、肝脾腫大及高死亡率，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由于EHNV感染早期癥狀不典型，且與部分魚類病毒病存在交叉反應(yīng)，精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)成為防控疫情的核心手段。目前，病毒分離培養(yǎng)與分子生物學(xué)檢測是確診EHNV感染的主要方法，需結(jié)合多種技術(shù)手段以提高檢測靈敏度與特異性。

檢測項(xiàng)目

針對(duì)EHNV的檢測項(xiàng)目主要包括：
1. 病毒分離與培養(yǎng)：通過接種敏感細(xì)胞系（如BF-2細(xì)胞）觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）；
2. 分子生物學(xué)檢測：RT-PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測病毒核酸；
3. 血清學(xué)檢測：ELISA或免疫熒光法檢測抗體；
4. 組織病理學(xué)檢查：觀察造血器官特征性病理變化。

檢測儀器

主要使用的儀器包括：
- 生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）必備設(shè)備
- 細(xì)胞培養(yǎng)箱及倒置顯微鏡（觀察CPE）
- PCR儀（常規(guī)/實(shí)時(shí)熒光定量）
- 電泳系統(tǒng)及凝膠成像儀
- 超高速離心機(jī)（病毒濃縮）
- 熒光顯微鏡（免疫熒光分析）

檢測方法

病毒分離流程：
1. 采集病魚肝、脾、腎組織勻漿后過濾除菌
2. 接種BF-2細(xì)胞系，28℃培養(yǎng)觀察7-14天
3. 通過CPE特征（細(xì)胞圓縮、脫落）初步判定
4. 電鏡觀察病毒粒子形態(tài)（六邊形，直徑150nm）

分子檢測關(guān)鍵步驟：
1. RNA提?。菏褂肨RIzol法或商業(yè)化試劑盒
2. 引物設(shè)計(jì)：針對(duì)MCP（主要衣殼蛋白）基因保守區(qū)域
3. RT-PCR擴(kuò)增：兩步法（逆轉(zhuǎn)錄+擴(kuò)增）
4. 產(chǎn)物分析：1.5%瓊脂糖凝膠電泳（預(yù)期條帶約500bp）
5. 測序驗(yàn)證：與GenBank參考序列比對(duì)（如登錄號(hào)NC_031086）

檢測標(biāo)準(zhǔn)

國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：
- OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》最新版
- ISO 17025實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系
國內(nèi)規(guī)范參考：
- GB/T 34747-2017《魚類病毒性疾病檢測規(guī)程》
- SN/T 3979-2014《水生動(dòng)物疫病檢疫技術(shù)規(guī)范》
陽性判定標(biāo)準(zhǔn)需滿足：
①細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)典型CPE且電鏡觀察到病毒粒子
②PCR擴(kuò)增出特異性條帶且測序相似度≥95%
③排除IHNV、VHSV等相似病毒的交叉反應(yīng)

（注：實(shí)際操作中建議聯(lián)合使用病毒分離與分子檢測方法，并結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，以提高診斷準(zhǔn)確性。樣本運(yùn)輸需符合生物安全要求，檢測過程需設(shè)置陽性和空白對(duì)照。）