豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測技術(shù)概述
豬偽狂犬病（Pseudorabies, PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，可導(dǎo)致豬群出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、繁殖障礙及高死亡率，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量PCR（Real-time PCR）因其高靈敏度、特異性和快速性，已成為PRV檢測的核心手段。該技術(shù)通過特異性引物和熒光探針靶向病毒核酸，實現(xiàn)病毒載量的精準(zhǔn)定量，為疾病監(jiān)測、疫苗效果評估及凈化方案制定提供科學(xué)依據(jù)。
檢測項目
豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測的主要目標(biāo)為病毒DNA中的特異性基因片段，通常選擇以下靶標(biāo)：
1. gE基因：用于區(qū)分野毒株與基因缺失疫苗株；
2. gB基因：作為PRV保守區(qū)域，用于病毒通用檢測；
3. TK基因：輔助判斷病毒毒力特性。
檢測樣本涵蓋病豬的腦組織、扁桃體、鼻拭子、流產(chǎn)胎兒組織及血液等。
檢測儀器
實時熒光PCR檢測需配備以下核心設(shè)備：
1. 實時熒光定量PCR儀（如ABI 7500、Bio-Rad CFX96）；
2. 核酸提取儀（如Qiagen QIAcube）；
3. 高速離心機與微量移液器；
4. 紫外分光光度計（用于核酸濃度與純度檢測）；
5. 生物安全柜（確保實驗操作無污染）。
檢測方法
檢測流程主要分為以下步驟：
1. 樣本前處理：組織樣本經(jīng)研磨、離心后取上清液，血液樣本直接裂解；
2. 核酸提取：采用試劑盒（如TRIzol法或柱提法）提取病毒DNA；
3. 引物與探針設(shè)計：針對PRV靶基因設(shè)計特異性引物及TaqMan探針；
4. PCR擴增：配置反應(yīng)體系（含Taq酶、dNTPs、熒光染料），設(shè)置擴增程序（通常為95℃預(yù)變性，隨后40個循環(huán)的變性-退火-延伸）；
5. 結(jié)果分析：通過Ct值判定病毒核酸含量，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。
檢測標(biāo)準(zhǔn)
PRV實時熒光PCR檢測需遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：
1. 國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 22917-2008《豬偽狂犬病熒光PCR檢測方法》；
2. 行業(yè)規(guī)范：農(nóng)業(yè)部《動物疫病診斷技術(shù)規(guī)范》中PRV分子檢測要求；
3. 國際參考：世界動物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動物診斷與疫苗手冊》推薦方法。
實驗需設(shè)置陽性對照（PRV標(biāo)準(zhǔn)品）、陰性對照（無核酸水）及內(nèi)參（如β-actin基因），確保結(jié)果可靠性。
結(jié)論
實時熒光PCR技術(shù)通過精準(zhǔn)檢測PRV核酸，可在感染早期（潛伏期）實現(xiàn)快速診斷，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)病毒分離或血清學(xué)方法。結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)與臨床特征，該技術(shù)為豬場生物安全防控及凈化計劃提供了強有力的技術(shù)支持。實際應(yīng)用中需嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，并定期進(jìn)行實驗室能力驗證，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可比性。
CMA認(rèn)證
檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實驗室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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