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禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-07-25 08:49:03 更新時(shí)間：2025-07-24 22:14:54

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)的重要性

禽流感（Avian Influenza, AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的一種高度接觸性傳染病，可對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅?？焖佟?zhǔn)確地檢測(cè)禽流感病毒是防控疫情的核心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，而熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-Time RT-PCR）憑借其高靈敏度、高特異性及快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，已成為診斷禽流感的首選技術(shù)。該方法能夠直接檢測(cè)病毒核酸，區(qū)分不同亞型（如H5、H7、H9等），適用于活禽、環(huán)境樣本及臨床病例的早期篩查。

檢測(cè)項(xiàng)目

禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)的核心目標(biāo)是檢測(cè)樣本中的AIV核酸，具體包括以下內(nèi)容：
1. 通用檢測(cè)：針對(duì)所有A型流感病毒保守基因（如M基因或NP基因）的檢測(cè)，確認(rèn)樣本中是否存在禽流感病毒。
2. 亞型分型：通過(guò)特異性引物和探針區(qū)分高致病性亞型（如H5N1、H7N9）與其他低致病性亞型。
3. 定量分析：結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒載量進(jìn)行定量評(píng)估，為流行病學(xué)研究和防控決策提供數(shù)據(jù)支持。

檢測(cè)儀器

熒光RT-PCR檢測(cè)需要依賴專業(yè)設(shè)備以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，主要儀器包括：
1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：如ABI 7500、Bio-Rad CFX96等，用于擴(kuò)增和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。
2. 核酸提取儀：全自動(dòng)或半自動(dòng)設(shè)備（如Qiagen QIAcube）用于高效提取病毒RNA。
3. 超低溫離心機(jī)：用于樣本預(yù)處理及核酸純化。
4. 生物安全柜：防止氣溶膠污染，保障操作人員安全。

檢測(cè)方法

禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)流程分為以下步驟：
1. 樣本處理：采集咽拭子、泄殖腔拭子或組織樣本，經(jīng)裂解液處理后釋放病毒RNA。
2. RNA提取：使用磁珠法或酚-氯仿法提取總RNA，并通過(guò)核酸濃度測(cè)定評(píng)估質(zhì)量。
3. 引物與探針設(shè)計(jì)：針對(duì)AIV的M基因設(shè)計(jì)通用引物及TaqMan探針，亞型檢測(cè)需特異性探針。
4. RT-PCR反應(yīng)體系：配置包含逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs及熒光標(biāo)記探針的混合液。
5. 擴(kuò)增程序：設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄（50℃ 30min）、預(yù)變性（95℃ 10min）及40個(gè)循環(huán)的變性-退火-延伸步驟。
6. 結(jié)果分析：通過(guò)Ct值判斷陽(yáng)性/陰性，結(jié)合熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

為確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和可比性，需嚴(yán)格遵守以下標(biāo)準(zhǔn)：
1. 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)》中關(guān)于AIV核酸檢測(cè)的推薦方法。
2. 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)《禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》（GB/T 19438.2-2004）規(guī)定引物序列、反應(yīng)條件及結(jié)果判定閾值。
3. 質(zhì)量控制：每批次檢測(cè)需包含陽(yáng)性對(duì)照（含AIV靶序列的質(zhì)粒）和陰性對(duì)照（無(wú)核酸水），Ct值≤35且無(wú)交叉污染視為有效。
4. 實(shí)驗(yàn)室規(guī)范：遵循生物安全二級(jí)（BSL-2）操作要求，防止樣本間污染及人員感染。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化流程與先進(jìn)技術(shù)結(jié)合，熒光RT-PCR為禽流感病毒的早期預(yù)警和精準(zhǔn)防控提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，同時(shí)為全球禽流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。