彗星實(shí)驗(yàn)去哪里做?中析研究所檢測中心可做各類彗星實(shí)驗(yàn)，出具第三方檢測報(bào)告。
一、彗星實(shí)驗(yàn)介紹
“彗星”實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，是一種通過檢測DNA鏈損傷來判別遺傳毒性的技術(shù)。它能有效地檢測并定量分析細(xì)胞中DNA單、雙鏈缺口損傷的程度。當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性DNA損傷因子誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時(shí)，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。在中性條件下，DNA片段可進(jìn)入凝膠發(fā)生遷移，而在堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來。在電泳過程中，這些DNA斷鏈及片段帶會(huì)離開核DNA 向正極遷移形成“彗星”狀圖像，而未受損傷的DNA部分保持球形。DNA受損越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈和斷片越多，長度也越大，在相同的電泳條件下遷移的DNA量就愈多，遷移的距離就愈長。通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可以測定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度，從而確定受試物的作用劑量與DNA損傷效應(yīng)的關(guān)系。該法檢測低濃度遺傳毒物具有高靈敏性，研究的細(xì)胞不需處于有絲分裂期。同時(shí)，這種技術(shù)只需要少量細(xì)胞。
二、客戶提供標(biāo)本或者相關(guān)資料
1. 研究用細(xì)胞或組織;
2. 檢測的指標(biāo);
3. 請(qǐng)客戶提供DNA受損詳細(xì)相關(guān)信息或相關(guān)文獻(xiàn)。
三、單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)流程
1.細(xì)胞接種：單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%～80%覆蓋;
2. DNA損傷處理;
3. 收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液;
4. 制備膠板;
5. 細(xì)胞裂解與電泳;
6. 中和與染色;
6. 熒光顯微鏡拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
四、最終結(jié)果
1. 陰性對(duì)照結(jié)果;
2. 具體試驗(yàn)流程(包括：實(shí)驗(yàn)步驟;主要儀器及試劑說明(含儀器廠家、型號(hào);試劑廠家、批號(hào)));
3. 原始實(shí)驗(yàn)圖片及數(shù)據(jù)。
1.制片
第一層膠: 將預(yù)熱45℃的80ul, 0.6% 的正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA ) 滴在磨 砂載玻片的磨砂面上, 迅速用一干凈玻片邊緣將膠鋪平, 或加蓋蓋玻片壓平膠面, 將玻片臵保濕盒內(nèi),4℃,10 min 使膠凝固。第二層膠: 將10ul待測細(xì)胞懸液盒75ul, 0.6% 的低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA ) 在
37℃混勻,滴在第一層膠板上(加蓋玻片者需先輕輕揭去蓋玻片) , 迅速加干凈的蓋玻片使膠鋪平, 將玻片臵保濕盒內(nèi), 4℃,10 min使膠凝固。第三層膠: 在凝固的LMA層上滴加37℃,0.6%LMA,蓋上蓋玻片,使其凝固。鋪第一層膠的目的是使第二層膠平整、附著緊密, 鋪第
三層膠的目的是對(duì)第二層膠中的細(xì)胞起保護(hù)作用。
2.裂解
移去蓋玻片, 將載玻片水平浸入新配臵的預(yù)冷4℃裂解液
( 2.5 mol/L NaCl, 100mmol/L Na2EDTA,10 mmol/L Tris, 1%肌氨酸鈉, pH = 10, 用前加入1% 體積的Triton X2100, 10%二甲亞砜) 中至少1小時(shí)。此步驟的目的是溶解細(xì)胞膜及核膜, 除去蛋白質(zhì)、RNA 等, 僅存留核骨架。
3.解旋
從裂解液中取出載玻片, 用蒸餾水浸泡或PBS沖洗, 洗去膠表面的鹽溶液然后將載玻片臵于水平電泳槽中,倒入新配制的堿性電泳緩沖液(1 mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH, pH = 13), 約沒過膠面0.25cm 左右, 堿解旋20～40 min, 以便使DNA 在堿性條件下解旋成單鏈DNA,使DNA 斷片在電泳場中易于遷移。
4.電泳
電壓25V,電流300mA,低溫避光,電泳20～40min。
5.中和
將載玻片取出,用0.4 mmol/L Tris 緩沖液(pH = 7.5) 中和2～3 次, 每 次5～15 min, 以除去堿和去污劑,以免影響染色效果。
6.染色觀察
根據(jù)顯微鏡的濾鏡種類選擇染色劑。常用吖啶橙(2mg/L)、溴化乙啶 (20mg/L)、碘化丙啶(2.5～5.0 mg/L )、4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(5 mg/L)或苯并嗯唑啉2-2喹啉等, 用量50～100ul, 滴臵膠板上, 蓋上蓋玻片, 24小時(shí)內(nèi)檢測, 時(shí)間過長將導(dǎo)致熒光減弱。上述過程均應(yīng)在黃光或紅光下操作, 以避免DNA 的額外損傷。
鋪膠方法：
鋪第一層膠時(shí)，玻片先放到水浴箱蓋上(我用的是90度以上的)或其他地方預(yù)熱，這樣鋪膠時(shí)膠不容易凝固，跟做血涂片時(shí)的推片類似，先讓膠在蓋玻片一側(cè)邊緣展開，然后放下蓋玻片即可。冰盒中放置幾分鐘后，推掉蓋玻片，將玻片放在水浴箱蓋上烘干，冷至室溫后再鋪第二層，感覺不易脫膠，并且很容易鋪開，方法同第一層。
CMA認(rèn)證
檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號(hào)：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可證書
證書編號(hào)：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號(hào)：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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