菌株準(zhǔn)備

　　結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv或耐藥株（內(nèi)部編號94789）經(jīng)小鼠體內(nèi)兩次增毒，于羅氏斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲斜面培養(yǎng)3周的細(xì)菌經(jīng)5μm無菌濾器( Millipore公司)制成單細(xì)胞菌懸液，經(jīng)羅氏斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，單細(xì)胞懸液菌濃度為1× 10⁷ CFU /ml，單細(xì)胞懸液分裝凍存于－80℃低溫冰箱備用。

動物的選擇

　　中緬樹鼩，1年齡，雄性，清潔級，體重100-170g，購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。實驗動物的使用得到了北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號ILAC-PC-2012-003），動物在感染前一周進(jìn)入醫(yī)學(xué)實驗動物研究所生物安全3級實驗室。

動物分組與感染

　　取樹鼩固定于保定袋中，暴露股靜脈，75%酒精擦拭消毒，靜脈注射250μl結(jié)核分枝桿菌H37Rv單細(xì)胞懸液，感染劑量為2.5× 10⁶ CFU（高劑量組），將H37Rv單細(xì)胞懸液稀釋1000倍，再靜脈注射250μl，感染劑量為2.5× 10³ CFU（低劑量組），高低劑量組各感染樹鼩10只，4只為正常對照組，股靜脈注射同等體積的生理鹽水，所有實驗均在醫(yī)學(xué)實驗動物研究所生物安全3級實驗室（BSL-3）進(jìn)行操作。

樣本采集

　　攻毒后每天觀察樹鼩活躍度，用紅外線體溫計監(jiān)測樹鼩體溫，每周稱量一次體重。

　　感染后5W高劑量組取4只（其中一只病重死亡，死亡后及時解剖），低劑量組取4只，正常對照組取4只，8W高、低劑量組各取3只，11W高劑量組取3只，低劑量組取3只腹腔注射2%戊巴比妥鈉（劑量為40mg/Kg）麻醉后心臟采血處死；1.6ml血液放置血沉管中，輕柔顛倒混勻數(shù)次，垂直靜置血沉架上30分鐘后讀取1小時血沉值，約1.5ml血液放置血常規(guī)管，輕柔顛倒混勻數(shù)次，用動物血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)； 無菌取各組織，先后經(jīng)過生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，進(jìn)行組織病理分析、荷菌量檢測、蛋白質(zhì)譜分析和部分差異蛋白轉(zhuǎn)錄水平的分析。

組織病理分析

　　將采集后的各組織用4%中性甲醛固定一周后，常規(guī)方法切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化。

組織荷菌量檢測

　　無菌取各組織約50mg，漂洗后加1ml生理鹽水用玻璃組織研磨器研磨，組織懸液經(jīng)無菌生理鹽水按照1：10稀釋后取0.1ml接種羅氏斜面培養(yǎng)基，平行接種3管。以上2個濃度均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周后進(jìn)行菌落計數(shù)。

組織切片抗酸染色

　　病理組織片按常規(guī)方法脫蠟后染色，將脫蠟后的組織切片置于濕盒內(nèi)，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分鐘后用細(xì)流水傾斜沖洗玻片至初染液洗掉后再滴上復(fù)染液脫色復(fù)染，直至玻片上的組織呈淡藍(lán)色；鏡檢。

蛋白質(zhì)譜分析

　　將高劑量組、低劑量組、正常對照組三組肺組織樣品于沸水中5分鐘滅活結(jié)核分枝桿菌。送公司進(jìn)行蛋白樣品的裂解、濃度測定， 蛋白酶解后用iTRAQ標(biāo)記各組肽段混合，用SCX柱進(jìn)行液相分離。基于Triple TOF 5600進(jìn)行LC-ESI-MS/MS質(zhì)譜分析?；贜CBI樹鼩核酸序列數(shù)據(jù)庫（50461 sequences），利用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot 2.3.02進(jìn)行檢索，選擇已經(jīng)建好的數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的搜索，并對質(zhì)譜質(zhì)量進(jìn)行評估。獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析，包括差異蛋白的篩選，進(jìn)行GO、COG注釋，差異蛋白Gene Ontology富集分析、pathway富集分析，以及多樣品間表達(dá)模式聚類分析。隨機(jī)選取部分差異蛋白，用SYBR-Green的熒光定量PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分子驗證。即從ITRAQ篩選的差異表達(dá)基因中選擇一部分與結(jié)核感染相關(guān)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。