小鼠模型是登革病毒感染及登革熱發(fā)病機(jī)制研究的重要工具?？蒲腥藛T最初使用登革病毒臨床分離株顱內(nèi)感染正常小鼠，感染效果差，且出現(xiàn)麻痹等神經(jīng)癥狀，不適合建立動(dòng)物模型。之后，鑒于干擾素的抗登革病毒作用，研究者利用缺乏IFN-ɑ/β、IFN-γ受體的AG129小鼠構(gòu)建登革病毒感染模型，但存在一定程度的免疫抑制，限制了該模型的應(yīng)用。然后，為建立免疫完整性更高的小鼠模型，使用交替?zhèn)鞔《局旮腥綢型干擾素受體敲除小鼠（Ifnar1^-/-）建立小鼠模型。這些模型都未能很好的展現(xiàn)血漿滲透、血小板降低、肝腎損害等重癥登革熱的典型表現(xiàn)。基于此，本研究擬通過(guò)小鼠體內(nèi)傳代，獲得登革病毒小鼠適應(yīng)株，感染Ifnar1^-/-小鼠建立重癥登革熱小鼠模型。

1. 小鼠感染：使用1ml胰島素注射器分別吸取100 μL病毒液（8×10⁶ Copies/μL），尾靜脈接種4-6周Ifnar1^-/-小鼠。每日進(jìn)行稱重，觀察小鼠臨床表現(xiàn)。發(fā)病率評(píng)分基于Orozco等人描述的1至5的等級(jí)：1. 健康；2. 輕度嗜睡；3. 嗜睡、豎毛、弓背；4. 嗜睡、豎毛、弓背、虛弱；5. 垂死。感染后第2、4、6、8天動(dòng)物眼眶采血，用于血常規(guī)檢查；分離并凍存血清，用于病毒載量測(cè)定；血漿用于細(xì)胞因子測(cè)定；分批安樂(lè)小鼠，采取腸、脾臟、腎臟、肝臟、腦等器官，用于病毒載量檢測(cè)及組織病理學(xué)觀察。

2. 病毒載量檢測(cè)：使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)小鼠血清和組織中的病毒核酸。簡(jiǎn)單的，配置反應(yīng)體系，上下游引物及探針序列分別為DENV-F: 5’-GAR AGA CCA GAG ATC CTG CTG TCT-3’，DENV-R: 5’-ACC ATT CCA TTT TCT GGC GTT-3’, Probe: (FAM)AGC ATC ATT CCA GGC AC (MGB)。Real-time PCR反應(yīng)條件為：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 15s；60℃ 60s，40個(gè)循環(huán)。

3. 全血細(xì)胞計(jì)數(shù)：收集300μL小鼠血液至EDTA抗凝管中，使用愛(ài)德士ProCyte Dx* 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)樣本進(jìn)行血細(xì)胞分析。方法如下：首先輸入樣本編號(hào)，選擇小鼠物種、類別和模式；其次準(zhǔn)備樣本：輕輕倒轉(zhuǎn)樣本10次，確保其混合均勻；最后將裝有樣本的采血管放入適配器；然后開(kāi)始分析。主要分析：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞比容（HCT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMPH）。

4. 組織病理學(xué)觀察：安樂(lè)小鼠，解剖采集腸、脾臟、肝臟、腎臟、腦組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE染色）。方法簡(jiǎn)述：組織塊經(jīng)10%的多聚甲醛固定、脫水透明后，置于熔化的石蠟中進(jìn)行包埋，進(jìn)而制作石蠟切片；切片脫蠟后進(jìn)行HE染色；進(jìn)一步的脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。

5. 細(xì)胞因子分析：收集300μL小鼠血液至EDTA抗凝管中，分離血漿，進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)。方法簡(jiǎn)述：1）稀釋試劑 ；2）溶解標(biāo)準(zhǔn)品并對(duì)倍稀釋；3）準(zhǔn)備微球，與樣本共同孵育；4）洗板；5）加入檢測(cè)抗體；6）再次洗板；7）加入SA-PE ；8）洗板； 9）上機(jī)檢測(cè) ；10）結(jié)果分析。