斑馬魚(yú)(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

1. 造模化合物

1-甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）是一種神經(jīng)毒素，常用 于制作帕金森病動(dòng)物模型。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型斑馬魚(yú) AB 或 TU 品系。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)和管理均按照常規(guī)方法。飼養(yǎng)空 間溫度 28-30°C。

3. 造?；衔锾幚?/p>

MPTP 為 Sigma (M0896) 產(chǎn)品，MPTP 母液用純水制備，濃度為100 µM， 儲(chǔ)存于－20 °C. MPTP工作液用飼養(yǎng)液稀釋至50、100、200、500 µM。將斑馬魚(yú)幼體暴露于MPTP 工作液24小時(shí)，收集幼體，進(jìn)行下一步處理。

4. RT-PCR檢測(cè)PD相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

收集斑馬魚(yú)于 TRIzol reagent (Sigma).提取總 RNA，進(jìn)行 RT-PCR 檢測(cè) PD 相關(guān)的基因表達(dá)水平。PCR 引物見(jiàn)表 1。

表 1. Primer pairs and parameters of PCR in the study

5. 原位RNA雜交

收集斑馬魚(yú)于4% paraformaldehyde固定。Th基因探針片段為PCR產(chǎn)物（表1）， 并被克隆到載體pGEM-T質(zhì)粒上。探針的合成按照試劑盒(DIG RNA labeling kit (Roche Applied Science, 1175041)）說(shuō)明制備th基因RNA雜交探針。按照操作程序 將斑馬魚(yú)樣本與探針溫育、檢測(cè)、拍照。

6. 原位免疫熒光檢測(cè)

按照常規(guī)程序，將斑馬魚(yú)幼體與TH蛋白單克隆抗體(Minipore, MAB318)溫 育，然后用FITC-標(biāo)記的二抗溫育、洗滌，顯微鏡下檢測(cè)、拍照。

7. Western blotting

用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑馬魚(yú)總蛋白，進(jìn) 行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，用PD相應(yīng)蛋白的抗體和二抗進(jìn)行檢測(cè)。β-ACTIN抗體，mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠

anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonal antibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no. 6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAb antibody (CST, catalog no. 2644)。

8. 斑馬魚(yú)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

幼體行為記錄采用ZebraLab (法國(guó)Viewpoint, ZebraLab 3.3)儀器，幼體逐個(gè)放 入96-孔板，(1 fish/well). 記錄運(yùn)動(dòng)距離、游泳持續(xù)時(shí)間、速度和游泳軌跡。每5 分鐘記錄一次數(shù)據(jù)。