6~8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6N 小鼠

1.1實(shí)驗(yàn)材料

 C57BL/6N 小鼠（北京維通利華，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐鐵注射液（江西創(chuàng)導(dǎo)動物保健品有限公司），血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測試劑盒（酶免公司），組織鐵檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），普魯士藍(lán)染色試劑盒（Solarbio），結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv（菌號為 93009，本室保存），中性羅氏培養(yǎng)管（珠海貝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分枝桿菌快速培養(yǎng)管（BD 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵過載小鼠模型建立

 6~8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6N 小鼠隨機(jī)分成陰性對照、低劑量、中劑量和高劑量 4 個小組，實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.5、15 mg/次，陰性對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，3 次/周，共計(jì) 4 周。定期觀察小鼠生長及精神狀態(tài)，稱重并記錄。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本所實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會（IACUC）批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指標(biāo)與組織鐵含量測定 

建模完成后將小鼠摘眼球采血，4 ℃凝結(jié)過夜，2000 g 4 ℃離心 10 min，分離小鼠血清并檢測血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量。解剖取小鼠心臟，肝臟、脾臟、肺、腎臟及小腸等組織器官，稱重后加 1ml 生理鹽水充分研磨并裂解組織碎片，12000 g 4 ℃離心 20 min，取上清并測定蛋白濃度。 血清生化檢測按試劑盒說明書進(jìn)行，組織鐵測定則按試劑盒測定方法計(jì)算相同蛋白濃度下各組織鐵含量。

1.2.3 鐵過載小鼠 Mtb 感染

SPF 級 C57BL/6N 隨機(jī)分成空白對照組、空白 Mtb 感染組、中劑量鐵過載模型組和中劑量鐵過載模型 Mtb 感染組，每組 6 只。其中 Mtb 感染組小鼠經(jīng)尾靜脈注射對數(shù)生長期 H37Rv 單細(xì)胞菌懸液 100 μl（1×10 6 CFU/ml），空白對照組注射等劑量無菌生理鹽水。本所 ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室（國衛(wèi) ABSL3-059） 正常飼喂， 觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠組織荷菌量測定

ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室動物解刨臺中解剖感染小鼠，無菌取小鼠肺、脾和肝臟組織；拍照記錄肺、脾和肝臟等器官大體病變情況，取小鼠左肺、脾頭及肝小葉于生物 安全柜內(nèi)稱重，依次經(jīng) 2%稀硫酸溶液、生理鹽水漂洗 30 s，1 ml 生理鹽水溫和 勻漿后進(jìn)行 10倍倍比稀釋，分別取 10^-3，10^-4和 10 ^-5 稀釋液 50 µl 均勻涂布于中 性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，37℃培養(yǎng) 4 周，計(jì)算相應(yīng)的組織器官荷菌量。另取 10 ^-1稀釋液 500 μl 接種于 BD BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)系統(tǒng)，通過記錄報(bào)陽時(shí)間進(jìn)行結(jié)核菌的快速檢測。

1.2.5 組織切片

HE染色與鐵染色 小鼠各組織器官，10%中性福爾馬林溶液固定 48 h。組織按長軸最大橫切面修塊、梯度乙醇脫水、石蠟包埋并切成 5 µm 厚度切片，HE 染色后掃描載玻片并保存為 NanoZoomer 數(shù)字病理圖像，不同視野下拍照并進(jìn)行組織病理學(xué)分析。鐵染色組織切片脫蠟至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸餾水充分沖洗切片5 min，入核固紅染色液，淡染細(xì)胞核 10 min，自來水沖洗 5 s。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察其病理形態(tài)改變及鐵沉積程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  

SPSS16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同實(shí)驗(yàn)處理組之間差異比較采用單因素方差分析，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱形圖采用 GraphPad Prism 5 軟件制作。