C57BL/6J小鼠

包括實驗材料（實驗動物、試劑、儀器）、實驗環(huán)境、細胞培養(yǎng)/載體構(gòu)建/蛋白表達/病原培養(yǎng)鑒定方法、實驗操作規(guī)程、動物處理倫理等內(nèi)容。

（一）構(gòu)建GPR68-FloxP小鼠

GPR68只有一個蛋白編碼區(qū)exon1。因此在exon1的兩邊設計gRNA靶點，將FloxP基因插入GPR68基因兩端。

圖1 插入位點設計

（二）CD4+T細胞特異性敲除GPR68小鼠的構(gòu)建

圖2 GPR68-FloxP小鼠與CD4-Cre小鼠雜交

 將GPR68-Flox/Flox小鼠與CD4-Cre小鼠雜交，子代小鼠即為CD4+T細胞GPR68特異敲除小鼠。

（三）皮下移植黑色素瘤模型的構(gòu)建

1、用0.25%胰酶消化細胞收集細胞懸液，用預冷的PBS重懸細胞，1000rpm離心5min，洗滌細胞兩次，除去單細胞懸液中的血清。

2、對細胞進行計數(shù)，用PBS稀釋細胞至濃度為2.5×10⁶個/mL，接種體積控制在0.2mL。

3、采用1mL無菌注射器于小鼠腋下部位接種細胞。接種時將單細胞懸液充分混勻，防止細胞成團導致活性降低以及接種細胞數(shù)不均，左手固定小鼠，右手執(zhí)注射器，針頭在皮下穿行時避免刺破皮膚與肌肉，到達接種位點并注射完畢后退出針頭時避免細胞懸液溢出。

4、每3天用游標卡尺測量腫瘤大小，測量腫瘤最長和最短直徑。腫瘤體積計算公式為V=a×b²/2(a為長軸，b為短軸)。

5、接種后第20天實驗結(jié)束，采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出腫瘤組織，稱量小鼠腫瘤重量。

CD4+T細胞GPR68特異敲除小鼠外觀表現(xiàn)與野生型C57BL/6J小鼠無明顯差異，生理條件無異常表型； DNA、mRNA、蛋白水平檢測CD4+T細胞中均無GPR68表達。

1. DNA鑒定

提取小鼠脾臟中的CD4+T細胞，采用全式金DNA提取試劑盒提取總DNA，進行PCR擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2. mRNA鑒定

    提取小鼠脾臟中的CD4+T細胞，采用賽默飛反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過Real time PCR鑒定小鼠CD4+T細胞中mRNA水平GPR68的表達情況。

3. 蛋白表達鑒定

提取小鼠脾臟中的CD4+T細胞，采用賽默飛蛋白定量試劑盒進行定量后通過Western blot鑒定小鼠CD4+T細胞中蛋白水平GPR68的表達情況。